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在真核细胞中,各个膜组份之间是通过囊泡来进行物质运输的。目前已知的主要有三种囊泡类型:COPⅠ包被的囊泡,COPⅡ包被的囊泡和Clathrin包被的囊泡。COPⅠ包被的囊泡主要是介导从高尔基体到内质网以及高尔基体自身内部的运输。COPⅠ蛋白复合物是由七个亚基组成,这七个亚基又形成了两个亚复合物,分别是α-,β’-,ε-COP组成的笼帽亚复合物以及β-,γ-,δ-,ζ-COP组成的结合货物蛋白亚复合物。最近笼帽亚复合物和γ-,ζ-COP亚基的晶体结构已经被解析了,COPⅠ中只有β-,δ-COP亚基的结构不清楚。本文解析了δ-COP的C末端274-511aa的2.3(A)分辨率的晶体结构。δ-COP-CTD跟AP2-Mu2-CTD很类似,都是由16个β折叠片组成的主体结构。为了研究δ-COP-CTD与货物蛋白相互作用的分子机制,我们通过SPR实验以及构建一系列不同的突变蛋白来检测δ-COP-CTD与货物蛋白中的sortingmotifs的结合常数,从中得到了影响它们相互作用的关键位点。
Arf1蛋白是一种小的GTP酶蛋白,它是COPⅠ包被的囊泡运输中的重要的调节蛋白。Arf1蛋白有两种不同的构象,一种是在胞质中的与GDP结合的非活性状态,另一种是在高尔基体膜上的与GTP结合的活性状态,这种状态的Arf1能够启动COPⅠ囊泡的形成。以前的研究表明突变位点Q71L能够将Arf1蛋白锁定在与GTP结合的构象,人们通常使用这种突变体来获得与GTP结合的Arf1蛋白。本文解析了第一个Arf1-Q71L突变体结合GDP的晶体结构,在分析了一系列相关的晶体结构之后我们发现,处于switchⅡ区域的突变位点Q71能够缩短核苷酸结合位点的残基与GTP之间的氢键,从而加强了蛋白与GTP的结合力。同时我们还发现当第71位残基从Gln突变成Leu之后,在包裹GTP磷酸的蛋白质口袋处原来的一片负电荷区域消失了,这可能也加强了口袋与GTP的结合。SwitchⅡ区域是Arf1与ArfGAP蛋白结合从而水解GTP的重要区域,Q71L突变位点正好处在该结合位点上,这也可能抑制了ArfGAP蛋白对Arf1的识别并降低了它水解GTP的活性。虽然Arf1-Q71L与GTP的结合相对于野生型蛋白增强了很多,但是我们的Arf1-Q71L-GDP结构说明该突变体并不总是处在与GTP结合的状态,当外界因素使得GTP水解成了GDP之后,Arf1-Q71L也与GDP结合并跟野生型蛋白与GDP结合的结构非常相似。