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第一部分:抗L3T4单抗对线粒体ADP/ATP载体合成肽诱导的心肌病免疫干预研究
目的:探讨抗L3T4单克隆抗体对自身免疫性心肌病的免疫治疗作用。
方法:以线粒体ADP/ATP载体肽免疫小鼠建立自身免疫性心肌病模型(免疫应答组,n=12);免疫耐受组小鼠(n=6)在被予肽免疫的第-1、0和1天,同时接受尾静脉注射抗L3T4单抗;免疫治疗组小鼠(n=6)在被予肽免疫的第3个月接受抗L3T4单抗的治疗;以不含肽的相同免疫液免疫小鼠作为对照组(n=12)。采用ELISA法检测小鼠血清抗线粒体ADP/ATP载体抗体动态变化及细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6和TNF-α的表达,观察小鼠心肌组织在光镜和电镜下的病理改变,计算左心室肌中的胶原纤维容积分数。
结果:免疫治疗组与免疫应答组小鼠抗ADP/ATP载体抗体检测均为阳性,但前者抗体水平有短暂性下降;免疫耐受组和对照组均为阴性。与心脏表现正常的对照组相比,在免疫的第30天,免疫应答组细胞因子表达均增高(P均<0.01),且以IFN-γ和IL-2为明显,心脏出现类心肌炎样改变;在第180天以IL-4、IL-6和TNF-α增高明显,心脏出现类扩张型心肌病样变。免疫治疗组变化与免疫应答组相似,但第180天的细胞因子增高水平较之偏低(P均<0.01)、心脏损伤较之略轻;免疫耐受组与对照组相比均无显著性差异。
结论:抗L3T4单抗能抑制抗线粒体ADP/ATP载体抗体的产生与细胞因子的表达,对线粒体ADP/ATP载体肽诱导的小鼠自身免疫性心肌病有治疗作用,且早期疗效更为明显,能诱导免疫耐受。
第二部分:抗L3T4单抗对自身免疫性心肌病小鼠的T细胞受体信号通路的影响
目的:通过研究T细胞信号分子的表达,探讨抗L3T4单抗抑制自身免疫性心肌病发生的分子机制。
方法:以线粒体ADP/ATP载体肽免疫小鼠以建立自身免疫性心肌病动物模型(免疫应答组,n=12);在予相同肽免疫的前期和后期分别加予抗L3T4单抗进行干预,建立免疫耐受组(n=6)和免疫治疗组(n=6)小鼠模型;以不含肽的相同免疫液免疫小鼠作为对照(n=12)。应用实时荧光定量PCR法检测各组小鼠T细胞内P56lck、P59fyn、Zap-70及细胞因子的表达,三色流式细胞术检测其Th亚群的分布,免疫细胞化学法观察其T细胞表面CD45的表达,比色法检测其T细胞内钙调神经磷酸酶(CaN)的活性。
结果:在免疫的第30天和第180天,对照组小鼠各检测指标均无明显变化;与对照组相比,在第30天,免疫应答组小鼠T细胞内P56lck、P59fyn、Zap-70及细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-6和IL-4的基因表达、Th1/Th2亚群的百分含量、CD45的表达强度和CaN活性均明显增高(P均<0.01),且以IFN-γ和IL-2的基因表达及Th1亚群含量增高更为显著;在第180天,P561ck、P59fyn、Zap-70及IL-6和IL-4的基因表达、Th2亚群含量、CD45的表达强度和CaN活性增高更为明显;而此时免疫治疗组也有类似改变,但其各项检测指标水平均低于免疫应答组(P均<0.01);免疫耐受组与对照组相比,P56lck偏高,但其明显低于免疫应答组和免疫治疗组(P均<0.01),余较对照组均无显著性差异。
结论:抗L3T4单抗通过调控T细胞受体信号转导通路抑制线粒体ADP/ATP载体肽诱导自身免疫性心肌病的发生和发展。
第三部分:抗L3T4单抗诱导小鼠对线粒体ADP/ATP载体肽免疫耐受的“感染性”研究
目的:验证抗L3T4单抗诱导小鼠对线粒体ADP/ATP载体肽的免疫耐受是否具有“感染性”。
方法:将第一部分实验中的第180天的各组小鼠杀死,取其新鲜脾细胞分别过继转输给另外3组同源近交系Balb/c小鼠:(1)DCM过继组(n=6):接受免疫应答组小鼠脾细胞;(2)耐受过继组(n=6):接受免疫耐受组脾细胞;(3)过继对照组(n=6):接受正常对照组的脾细胞,并在过继后予与第一部分实验相同的线粒体ADP/ATP肽免疫耐受过继组。采用ELISA法检测各组小鼠的血清抗ADP/ATP载体自身抗体,以实时荧光定量PCR检测小鼠T细胞内细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-4基因表达,以3色流式细胞术检测Th1/Th2亚群的分布,并用光镜与电镜进行心脏形态学和心肌病理组织学观察。
结果:DCM过继组小鼠血清抗ADP/ATP自身抗体检测均为阳性,耐受过继组与过继对照组均为阴性。在过继后的第180天,与正常的过继对照组相比,DCM过继组小鼠T细胞内细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-4mRNA表达水平均明显增高,且以IL-4更为显著(P均<0.01);Th1/Th2细胞亚群百分含量均增多,且以Th2亚群更为明显(P均<0.01);心脏出现类扩张型心肌病样改变。耐受过继组细胞因子水平和Th细胞亚群分布较对照组均无显著性差异,心脏形态及心肌组织病理学检查均无明显异常改变。各组小鼠检测指标分别与相应的过继前免疫应答组、免疫耐受组和对照组相比,均无显著性差异。
结论:抗L3T4单抗能抑制线粒体ADP/ATP载体肽诱导小鼠产生自身免疫性扩张型心肌病,且此免疫耐受能“感染”给同源受体小鼠。Th1/Th2细胞亚群的平衡在此耐受中起重要作用。