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油菜是我国主要的油料作物,杂种优势利用是提高油菜产量、品质和抗性的有效途径,而雄性不育是油菜杂种优势利用的最主要途径。油菜隐性细胞核雄性不育因其具有不育性彻底稳定、细胞质来源丰富、恢复源广等优点,已经成为国内杂种优势利用的一条重要途径,但是目前对隐性核不育机理的研究却比较滞后。隐性核不育系S45A来源于四川大学,由潘涛等(1988)在甘蓝型油菜品种Oro中发现的自然突变体衍生而来,经过多代的兄妹交保存,遗传分析证明S45A的不育性受两对重叠隐性基因控制,但是在杂交制种时需人工拔除母本行中50%的可育株,限制了其广泛应用。基于以上,本研究开展了以下两个方向的工作：以S45AB作为基础材料,利用细胞学和分子生物学的方法,阐述了该核不育系的分子机理,另一方面利用转基因的方法对创建此种核不育系的保持系进行了初步研究。主要研究结果如下：1.甘蓝型油菜S45AB隐性核不育的分子机理研究1.1扫描电镜(SEM)观察花粉粒和花药的形态,结果表明可育材料S45B形成的花粉粒比较饱满,花粉外壁有复杂的网状结构。而不育材料S45A的花粉粒瘪小,破裂,花粉外壁平滑；花药的观察,S45A的花药比S45B要短,S45B的花药表皮有线状或者盘状的脂质层,而S45A花药表皮较为光滑,看不见脂质晶体。1.2透射电镜(TEM)观察发现可育花药和不育花药在小孢子母细胞时期没有明显差异。不育材料,在四分体时期花粉外壁的发育出现异常,表现为外壁基柱不能正常形成或者伸长。随后,在不育材料中小孢子没有形成正常的花粉外壁,小孢子的发育停留在单核期并最终解体。不育花药的绒毡层与可育花药相比,从单核期开始脂类物质的积累减少,同时绒毡层液泡化和肥大明显。以上研究表明,S45A花药发育的异常最早发生在四分体时期,败育主要是由于孢粉素合成的缺失和花粉外壁不能正常形成,绒毡层发育和脂类物质沉积的异常。对于花药表皮的观察表明在第一次有丝分裂后,可育花药表皮有丰富的脂类物质的沉积,而不育花药表皮的脂质沉积较少。1.3与TEM观察到的绒毡层细胞不正常的肥大一致,TUNEL(for terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling)分析的结果表明,S45A突变体绒毡层降解的异常是由不育花药绒毡层的PCD (programmed cell death)受阻所致。1.4前人通过精细定位将BnMs1基因和BnMs2基因锁定在拟南芥第一染色体的同一区段,包括三个候选基因,其中有两个基因可能与花粉发育相关,通过互补实验,确定了来自于植物细胞色素(cytochrome P450, CYP450)P450基因家族的候选基因BnCYP704B1能够恢复S45A的育性,是隐性核不育系S45A的恢复基因。1.5通过RT-PCR, mRNA原位杂交表明,BnCYP704B1基因在雄蕊中表达,并且是在绒毡层中特异表达。其表达起始于小孢子母细胞减数分裂时期,在四分体和单核期达最大,以后逐渐减弱至终止。启动子-GUS分析表明,BnCYP704B1是一个绒毡层特异表达的基因,其表达产物是小孢子发育所必需的。1.6分别对可育花药和不育花药表皮蜡质和角质的含量进行了测定,结果表明单位重量的不育花药表皮蜡质含量与可育花药相比没有明显变化,而角质含量却显著减少。1.7对BnCYP704B1基因编码的蛋白质序列在NCBI上检索与之同源来自不同物种的蛋白质序列表明,BnCYP704B1与拟南芥的CYP704B1和水稻的CYP704B2同源性较高,目前的报道显示CYP704B1和CYP704B2均催化中长链脂肪酸的ω-羟基化。据此推测,BnCYP704B1基因可能编码脂肪酸羟基化的酶,参与花粉外壁的合成。1.819份油菜材料的比较测序结果显示对于Bncyp704B1-1基因,两个错义突变中第一个突变位点是不育材料中特异的,是导致Bncyp704B1-1功能失活,S45A败育的原因。1.9对BnCYP704B1亚细胞定位的结果表明该蛋白定位在内质网中,可能参与了脂肪酸的羟基化。1.10对不育材料和可育材料各个时期的花蕾总脂类的测定结果表明,不育花蕾总脂肪酸的含量与可育花蕾相比极显著减少,进一步的确定了BnCYP704B1基因参与了绒毡层中脂类的代谢。通过以上问题的研究,可以对两对重叠基因控制的隐性核不育材料S45A的败育机理做出揭示：我室成功分离的恢复基因BnCYP704B1参与了油菜花药发育过程中花药表皮角质和花粉外壁孢粉素物质的合成。BnCYP704B1功能的缺失导致了绒毡层不正常的脂类代谢和PCD的受阻,使得小孢子的发育受到严重的影响,从而导致完全的雄性不育和花药表皮发育的异常。2.利用BnCYP704B1基因创建隐性核不育保持系的初步研究2.1构建了两个用于创建保持系的载体：载体一是利用化学诱导性的启动子诱导致死基因在苗期表达,用于生产不育系；载体二是采用化学诱导性的启动子替换掉恢复基因BnCYP704B1原有的启动子,从而实现不育系的繁殖。2.2对以上两个载体转化隐性核不育系S45A,载体一获得了15个单株,对这些单株利用纸床和穴盘发芽进行表型观察,筛选到两个初步有表型的株系,以供进一步分析,载体二未能获得转化株。