目的观察胰高血糖素样肽-1(GLP-1)对免疫细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和胰腺细胞中炎症细胞因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和白介素-1β(IL-1β)表达的影响,以及GLP-1对糖尿病大鼠主动脉MCP-1和IL-1β基因转录的作用,揭示GLP-1参与炎症调节的具体作用靶点。方法1.细胞分离和培养1.1免疫细胞(大鼠腹腔巨噬细胞)吸取无血清的DMEM培养基进行大鼠腹腔注射。收集腹腔液离心,正常糖培养基重悬细胞沉淀,贴壁12h后用DMEM培养基洗涤以除去未贴壁细胞,贴壁的巨噬细胞培养过夜后用于后续实验。1.2大血管细胞(大鼠主动脉内皮细胞和大鼠主动脉平滑肌细胞)1.2.1大鼠主动脉内皮细胞取新鲜大鼠主动脉,将内膜外翻,胶原酶消化后剪成小块,内膜朝下贴壁培养于正常糖培养基中,取3-7代细胞用于后续实验。1.2.2大鼠主动脉平滑肌细胞取新鲜大鼠主动脉,将内膜刮除并剥除外膜,剪成小块贴壁培养于正常糖培养基中,取3-7代细胞用于后续实验。1.3胰腺细胞1.3.1人PANC-1细胞(人胰腺导管癌细胞株)于高糖培养基中常规培养。1.3.2人SW1990细胞(人胰腺腺泡瘤细胞株)于高糖培养基中常规培养。1.3.3大鼠INS-1细胞(大鼠胰岛瘤细胞株)于高糖培养基中常规培养。2.Ⅱ型糖尿病大鼠模型的构建实验组大鼠用高脂高糖饲料喂养4周,对照组大鼠常规饲养4周。上述饲料喂养4周后,所有大鼠禁食10h,实验组注射链脲佐菌素(STZ),对照组注射缓冲液。大鼠禁食12h后,连续3天空腹血糖>16.7mmol/L,即可认为造模成功。3.实验步骤3.1体外实验本实验主要观察免疫细胞(大鼠腹腔巨噬细胞)、大血管细胞(大鼠主动脉内皮细胞、大鼠主动脉平滑肌细胞)和胰腺细胞(人PANC-1.人SW1990和大鼠INS-1细胞)中炎症细胞因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和白介素-1β(IL-1β)的mRNA转录水平。当细胞生长融合至75～90%后,先用无糖无血清DMEM培养基饥饿6-8h,再进行条件培养和刺激实验。每种细胞实验均含有4组：正常糖(5.56mmol)处理组,正常糖+GLP-1(10nmol/L)处理组,高糖(25mmol)处理组,高糖+GLP-1(10nmol/L)处理组,体外培养72h,收集细胞用于后续实验。3.2体内实验将大鼠随机分为3组,每组8只。第1组大鼠用常规饲料喂养4周,腹腔注射生理盐水作为正常对照组：第2组大鼠用高脂高糖饲料喂养4周,并用STZ诱导为Ⅱ型糖尿病模型大鼠,即为糖尿病组；第3组大鼠用高脂高糖饲料喂养4周,在注射STZ后两天,通过缓释泵给予GLP-1,此为灌注组。上述大鼠成功建模10天后处死,用于后续实验研究。4.荧光定量PCR检测细胞因子mRNA转录水平通过荧光定量PCR方法检测6种细胞经不同刺激处理后MCP-1和IL-1β的mRNA转录水平。用TRIzol提取各组细胞的总RNA并取1μg RNA逆转录成cDNA。荧光定量PCR体系配置使用SYBR Green试剂盒,并使用ABI7500系统上机检测。将3组大鼠模型的主动脉用液氮碾磨后置于BiooPure中充分裂解并提取总RNA,用前述方法合成cDNA并进行荧光定量PCR。目的基因的mRNA转录水平通过内参β-actin的mRNA转录水平进行校正,结果计算使用△△Ct法。荧光定量PCR引物序列如下：大鼠β-actin上游：5’CAACACAGTGCTGTCTGGTG3’;下游：5’GATCCACATCTGCTGGAAG3’;大鼠MCP-1上游：5’ACAGAGGCCAGCCCAGAAACCA3’;下游：5’GGGCATTAACTGCATCTGGCTGAG3’:大鼠IL-1β上游：5’TCAGGAAGGCAGTGTCACTCATTG3’下游：5’ACACACTAGCAGGTCGTCATCATC3’人β-actin上游：5’AGCCTTCCTTCCTGGGCAT3’;下游：5’ATCTGCTGGAAGGTGGACAG3’;人MCP-1上游：5’ACTGAAGCTCGCACTCTCGCCT3’;下游：5’GGCATTGATTGCATCTGGCTGAGCG3’人IL-1β上游：5’GCCCTAAACAGATGAAGTGCTCCTT3’;下游：5’TGTGGGCAGGGAACCAGCAT3’。每一个实验至少重复三次,实验数据用均数±标准差表示。统计分析软件使用SPSS13.0,两个组别的统计分析使用两独立样本t检验,当组别大于两个时使用One-way ANOVA统计方法。P<0.05被认为有统计学差异。结果1.体外实验1.1高糖上调MCP-1和IL-1β mRNA的转录水平1.1.1免疫细胞(大鼠腹腔巨噬细胞)我们首先验证了反应系统中引物的特异性和PCR体系的稳定性。采用高糖刺激大鼠腹腔巨噬细胞模拟体内糖尿病状态。1.1.1.1MCP-1结果显示高糖刺激能上调大鼠腹腔巨噬细胞中MCP-1mRNA的水平,上调幅度为1.5倍(P=0.014,95%可信区间为-0.260～-0.082)。1.1.1.2IL-1β结果显示高糖刺激能上调大鼠腹腔巨噬细胞中IL-1β mRNA的水平,上调幅度为1.3倍(P=0.033,95%可信区间为-0.234～-0.016)。1.1.2大血管细胞(大鼠主动脉内皮细胞和大鼠主动脉平滑肌细胞)为了研究糖尿病大血管炎症状态,本实验用高糖分别刺激大鼠主动脉内皮细胞和大鼠主动脉平滑肌细胞。1.1.2.1大鼠主动脉内皮细胞1.1.2.1.1MCP-1结果表明高糖刺激大鼠主动脉内皮细胞后,细胞内MCP-1的表达量没有变化(P=0.083,95%可信区间为-0.001～0.012)。1.1.2.1.2IL-1β在本体系条件下检测不到大鼠主动脉内皮细胞中IL-1β mRNA的表达。1.1.2.2大鼠主动脉平滑肌细胞1.1.2.2.1MCP-1结果表明高糖能增加大鼠主动脉平滑肌细胞中MCP-1的mRNA水平,增加幅度为1.9倍(P=0.007,95%可信区间为-0.364～-0.169)。1.1.2.2.2IL-1β在本体系条件下检测不到大鼠主动脉平滑肌细胞中IL-1β mRNA的表达。1.1.3胰腺细胞本实验分别用高糖刺激胰腺内分泌和外分泌细胞,模拟体内糖尿病状态时的胰腺环境。1.1.3.1人PANC-1细胞(人胰腺导管癌细胞株)1.1.3.1.1MCP-1结果显示高糖刺激能上调人PANC-1细胞中MCP-1mRNA的水平,上调了2.3倍(P=0.000,95%可信区间为-0.382～-0.356)。1.1.3.1.2IL-1β结果显示高糖能上调人PANC-1细胞中IL-1β mRNA的水平,上调了8.2倍(P=0.000,95%可信区间为-1.057～-0.762)。1.1.3.2人SW1990细胞(人胰腺腺泡瘤细胞株)1.1.3.2.1MCP-1在本体系条件下检测不到人SW1990细胞中MCP-1mRNA的表达。1.1.3.2.2IL-1β在本体系条件下检测不到人SW1990细胞中IL-1β mRNA的表达。1.1.3.3大鼠INS-1细胞(大鼠胰岛瘤细胞株)1.1.3.3.1MCP-1在本体系条件下检测不到大鼠INS-1细胞中MCP-1mRNA的表达。1.1.3.3.2IL-1β在本体系条件下检测不到大鼠INS-1细胞中IL-1β mRNA的表达。1.2在正常糖和高糖培养条件下,GLP-1均能上调观察细胞的MCP-1和IL-1βmRNA转录水平1.2.1GLP-1时间依赖曲线首先我们以大鼠主动脉内皮细胞为对象,采用荧光定量PCR方法检测了GLP-1影响MCP-1mRNA水平的时间依赖曲线。用GLP-1分别刺激细胞0、4、12、24、48、72小时,MCP-1的表达量明显不同。MCP-1的转录在GLP-1处理4h后即显著升高,比0小时升高16.6倍(P=0.000,95%可信区间为1.172,1.267)；该高表达水平持续到24h之间；在GLP-1处理48h时,MCP-1的mRNA水平是Oh的54.8倍(P=0.000,95%可信区间为1.691～1.786),是24h的4.6倍(P=0.000,95%可信区间为0.613～0.708)；当GLP-1处理72h时,细胞MCP-1基因转录水平是0h的69.8倍(P=0.000,95%可信区间为1.796～1.891),是48h的1.3倍(P=0.000,95%可信区间为0.058～0.153)。1.2.2免疫细胞(大鼠腹腔巨噬细胞)我们在前面已经观察到高糖能上调大鼠腹腔巨噬细胞内炎性因子的表达,本实验将分别观察在正常糖和高糖培养条件下均给予GLP-1处理后,MCP-1和IL-1β的转录状况。1.2.2.1MCP-1在正常糖培养条件下,GLP-1升高大鼠腹腔巨噬细胞中MCP-1mRNA的转录水平34.6倍(P=0.000,95%可信区间为1.494～1.585)；在高糖培养条件下,GLP-1升高大鼠腹腔巨噬细胞中MCP-1mRNA的转录水平22.6倍(P=0.000,95%可信区间为1.308～1.400)。1.2.2.2IL-1β在正常糖培养条件下,GLP-1能升高大鼠腹腔巨噬细胞中IL-1β mRNA的转录水平94.5倍(P=0.000,95%可信区间为1.907～2.046)；在高糖培养条件下,GLP-1增加大鼠腹腔巨噬细胞中IL-1β mRNA的转录水平127.3倍(P=0.000,95%可信区间为2.038～2.177)。当同时加入高糖和GLP-1处理时,能进一步增加IL-1β的基因转录水平,是正常糖+GLP-1处理组的1.8倍(P=0.000,95%可信区间为0.187～0.326)。1.2.3大血管细胞(大鼠主动脉内皮细胞和大鼠主动脉平滑肌细胞)大血管损伤是糖尿病的重要并发症之一,我们已经观察到高血糖能提高细胞炎性因子的表达。本实验将进一步观察在GLP-1作用下,大血管内皮细胞和平滑肌细胞内炎性因子的表达。1.2.3.1大鼠主动脉内皮细胞1.2.3.1.1MCP-1在正常糖培养条件下,GLP-1增加大鼠主动脉内皮细胞中MCP-1mRNA67.3倍(P=0.000,95%可信区间为1.813～1.842)；在高糖培养条件下,GLP-1增加大鼠主动脉内皮细胞中MCP-1mRNA65.3倍(P=0.000,95%可信区间为1.801～1.830)。1.2.3.1.2IL-1β在仅加入正常糖或高糖刺激情况下,在本体系条件下检测不到大鼠主动脉内皮细胞中IL-1β的基因表达,而当加入GLP-1后本体系可检测到IL-1β的基因表达,因此,可认为GLP-1同样能上调大鼠主动脉内皮细胞中IL-1β的基因转录水平。1.2.3.2大鼠主动脉平滑肌细胞1.2.3.2.1MCP-1在正常糖培养条件下,GLP-1升高大鼠主动脉平滑肌细胞MCP-1基因表达158.2倍(P=0.000,95%可信区间为1.991～2.404)；在高糖培养条件下,GLP-1升高大鼠主动脉平滑肌细胞MCP-1基因表达114.6倍(P=0.000,95%可信区间为1.895～2.226)。1.2.3.2.2IL-1β在本体系条件下检测不到大鼠主动脉平滑肌细胞中IL-1β的表达。1.2.4胰腺细胞虽然GLP-1类似物已经用于糖尿病临床治疗中,但有GLP-1引起胰腺炎的报道。为了明确糖尿病高血糖状态下GLP-1是否能刺激胰腺内炎性分子的表达,我们选用源自胰腺内分泌和外分泌的不同细胞进行检测观察。1.2.4.1人PANC-1细胞(人胰腺导管癌细胞株)1.2.4.1.1MCP-1在正常糖培养条件下,GLP-1能升高人PANC-1细胞MCP-1的基因表达水平1.5倍(P=0.000,95%可信区间为0.146～0.209)；在高糖培养条件下,GLP-1能升高人PANC-1细胞MCP-1的基因表达水平2.2倍(P=0.000,95%可信区间为0.300～0.364)。而当高糖与GLP-1联合作用时能进一步增加MCP-1的基因转录水平至9.5倍(P=0.000,95%可信区间为0.492～0.556)。1.2.4.1.2IL-1β在正常糖培养条件下,GLP-1对人PANC-1细胞IL-1β的基因表达没影响(P=0.213,95%可信区间为-0.039～0.148)；在高糖培养条件下,GLP-1对人PANC-1细胞IL-1β的基因表达没影响(P=0.734,95%可信区间为-0.108～0.079)。1.2.4.2人SW1990细胞(人胰腺腺泡瘤细胞株)1.2.4.2.1MCP-1在本体系条件下检测不到人SW1990细胞中MCP-1mRNA的表达。1.2.4.2.2IL-1β在本体系条件下检测不到人SW1990细胞中IL-1β mRNA的表达。1.2.4.3大鼠INS-1细胞(大鼠胰岛瘤细胞株)1.2.4.3.1MCP-1在本体系条件下检测不到大鼠INS-1细胞中MCP-1mRNA的表达。1.2.4.3.2IL-1β在本体系条件下检测不到大鼠INS-1细胞中IL-1β mRNA的表达。2.体内实验体外已经观察到高糖和GLP-1均能上调炎性因子的表达,我们设计体内实验进一步验证体外实验结果。2.1MCP-1糖尿病大鼠主动脉中MCP-1mRNA转录水平是正常组的2.2倍(P=0.000,95%可信区间为0.245～0.421)；经GLP-1灌注糖尿病大鼠主动脉中MCP-1基因转录水平是糖尿病组的1.6倍(P=0.001,95%可信区间为0.129～0.306)。2.2IL-1β糖尿病大鼠主动脉中IL-1β mRNA转录水平是正常组的5.8倍(P=0.002,95%可信区间为0.414～1.119)；经GLP-1灌注糖尿病大鼠主动脉中IL-1β基因转录水平是糖尿病组的2.6倍(P=0.023,95%可信区间为0.085～0.790)。结论1.体外实验1.1在大鼠腹腔巨噬细胞中,高糖刺激能引起MCP-1和IL-1β基因转录水平的升高,GLP-1处理能进一步上调MCP-1和IL-1β基因的转录。1.2在大鼠主动脉内皮细胞和大鼠主动脉平滑肌细胞中,高糖刺激对大鼠主动脉内皮细胞MCP-1的表达没影响,在仅有正常糖或高糖刺激条件下,在本体系条件下检测不到大鼠主动脉内皮细胞IL-1β的表达,GLP-1处理能上调大鼠主动脉内皮细胞中MCP-1和IL-1β基因的转录；高糖刺激能引起大鼠主动脉平滑肌细胞MCP-1基因转录水平的升高,GLP-1处理能进一步上调大鼠主动脉平滑肌细胞MCP-1基因的转录,在本体系条件下检测不到大鼠主动脉平滑肌细胞IL-1β的表达。1.3在胰腺细胞中,高糖刺激能引起人PANC-1细胞MCP-1和IL-1β基因转录水平的升高,GLP-1处理能进一步上调人PANC-1细胞MCP-1的基因转录但对IL-1β没影响；在本体系条件下检测不到人SW1990和大鼠INS-1细胞中MCP-1和IL-1β的表达。2.体内实验糖尿病大鼠主动脉中MCP-1和IL-1β mRNA转录水平比正常组高,经GLP-1灌注糖尿病大鼠主动脉中MCP-1和IL-1β基因转录水平比糖尿病组高。意义该研究发现高糖处理能促进大鼠腹腔巨噬细胞、大鼠平滑肌细胞和人PANC-1细胞中炎性因子MCP-1或IL-1β的表达；且糖尿病大鼠主动脉MCP-1和IL-1β基因转录水平比正常组高,说明炎性因素在糖尿病发病中具有一定作用。GLP-1处理能刺激大鼠腹腔巨噬细胞、大鼠内皮细胞、大鼠平滑肌细胞和人PANC-1细胞中炎性因子MCP-1或IL-1β的过高表达；且经GLP-1灌注糖尿病大鼠主动脉MCP-1和IL-1β基因转录水平比糖尿病组高,提示在GLP-1临床应用中,需要仔细考虑和评估引发炎症的风险。