羧肽酶（Carboxypeptidase）是可水解蛋白肽链C末端氨基酸残基的一类蛋白酶,广泛存在于高等动植物组织及真菌中。在医药和食品等领域的应用十分广泛,虽然目前已有不少关于羧肽酶的研究,但是这些研究大多数集中于微生物产酶及羧肽酶的克隆重组,而对动物,尤其是存在于如南极磷虾等具有特殊适冷特性动物体内的羧肽酶研究相对较少。因此,本课题以南极磷虾为原料,从中分离纯化出一种羧肽酶,并对该酶的酶学性质进行了研究;并基于课题组前期通过转录组测序获取的南极磷虾全基因序列,并对羧肽酶基因进行调取,利用生物信息学方法对其结构预测,从而揭示其在极寒环境中发挥高效催化性能的机理,为其分子修饰及在食品和生物工程等领域的应用提供参考。本课题采用缓冲液提取、硫酸铵分级盐析,DEAE-琼脂糖凝胶FF阴离子层析、Sephadex G-100凝胶层析后,从南极磷虾匀浆液中分离纯化出一种羧肽酶,经SDS-PAGE凝胶电泳分析,纯化出的羧肽酶在胶条上显示为一条带,其分子量为30ku。酶学性质实验结果表明,该酶的最适反应温度为30°C,最适反应p H为8.0,热稳定性较差,即使在4°C下,保温超过2h酶活性也会急剧下降。金属离子Ni²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺具有激活作用,浓度为1mmol/L时,Zn²⁺的激活作用较显著;当浓度为5mmol/L时,Mn²⁺的激活作用较显著;当浓度为10mmol/L时,Mg²⁺激活作用较显著。而Ca²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺起抑制作用,其中Cu²⁺抑制效果最明显;对巯基有修饰作用的抑制剂DTT、β-巯基乙醇,对其有抑制作用;金属蛋白酶抑制剂EDTA、1,10-菲罗啉对该酶活性有明显的抑制作用;而丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）抑制作用并不强烈。以脲酰-L-苯丙氨酸为底物溶液,测得该酶K_m为0.0059mg/m L、V_max为4.9091U/min。本研究中共获取两条南极磷虾羧肽酶的完整基因信息,编号为c31046＿g1＿i1的c DNA全长1070bp,最大ORF区编码具有301个氨基酸残基的南极磷虾羧肽酶CP1;编号为c35128＿g2＿i2的c DNA全长2216bp,最大ORF区编码具有562个氨基酸残基的南极磷虾羧肽酶CP2。两条基因序列信息已提交Gen Bank,其登录号分别为MK696972和MK696973。通过对南极磷虾羧肽酶及牛羧肽酶的动力学比较,并采用生物信息学方法,对筛选出来的南极磷虾羧肽酶的理化性质、氨基酸序列比对和二级、三级结构预测,从而对南极磷虾羧肽酶的结构及适冷性进行研究。结果显示,在4°C和30°C下,南极磷虾羧肽酶催化效率及对底物的亲和性均高于常温牛（胰）羧肽酶;CP1氨基酸序列与河鳌虾（Astacus astacus）、南美白对虾（Penaeus vannamei）、太平洋牡蛎（Crassostrea virginica）等同源性较高;活性位点、Zn结合位点等存在保守性;CP1比其他常温动物含有更高比例的天冬氨酸（Asp）和较低比例的脯氨酸（Pro）、精氨酸（Arg）、苯丙氨酸（Phe）;二级及三级结构预测结果表明,CP1二级元件主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,与其他常温动物相比,α-螺旋占比更低,松散的无规则卷曲占比相对较高,使得南极磷虾羧肽酶整体蛋白结构较松散。通过对南极磷虾羧肽酶CP2进行保守性区域分析,其与所有比对物种的羧肽酶序列在Zn结合位点、催化中心的活性位点等多区域具有严格的保守性。CP2氨基酸序列与南美白对虾（Penaeus vannamei）、马蹄蟹（Limulus polyphemus）桡足类（Eurytemora affinis）、太平洋牡蛎（Crassostrea virginica）等同源性较高;CP2较其他常温动物含有较低比列的脯氨酸（Pro）、酪氨酸（Tyr）、精氨酸（Arg）+赖氨酸K（Lys）;经对CP2进行二级、三级结构预测,结果显示CP2二级元件主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,且无规则卷曲占比相对较高。