猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）,是由猪流行性腹泻病毒(（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起猪的一种急性、高度接触性肠道传染病。自2010年以来,PEDV变异株在我国大部分地区的猪场开始爆发,仔猪死亡率可达80%～100%,给我国养猪业造成重大经济损失。S蛋白是PEDV最主要保护性抗原,也是变异最大蛋白,基于S蛋白的进化分析发现,目前的流行毒大多为基因II型,而传统疫苗均为基因I型,基因II型流行毒与基因I型传统疫苗毒在S基因,尤其是S1的核心抗原区（Core neutralizing epitope,COE）已发生大量突变,并已引起S蛋白结构和部分糖基化位点的改变,这也是导致传统的PED疫苗对流行毒保护率显著下降的根本原因。为解决传统PED疫苗保护力差,以及开发高交叉保护力的新型疫苗,本文首先对S基因COE进行高频位点突变和糖基化位点改造（去除糖基化位点或添加糖基化位点）,其次将wt COE（COE）和突变型COE（m COEs）分别克隆到猪3型腺病毒（porcine adenovirus type3,PAV-3）载体骨架,构建重组腺病毒PAV3-COE和PAV3-m COEs。最后以重组腺病毒PAV3-COE和PAV3-m COEs免疫小鼠,筛选可诱导高水平中和抗体的S基因COE突变体,为新一代高效PED腺病毒载体口服疫苗的研究奠定基础。本研究由两部分内容组成:1.重组PAV-3的构建和鉴定本研究通过分析统计不同流行毒株S蛋白COE区（491～638 aa）高频突变和糖基化突变位点,并参照MERS相关文献进行糖基化引入。通过PCR和融合PCR扩增带有同源臂的COE突变后核酸序列,用In-fusion重组技术将改造的突变体片段插入到PAV3基因组中,构建重组猪腺病毒载体p FPAV3-COEs。把Pac I线性化的PAV3-COE和PAV3-m COEs通过Lipofect reagent转染VR1BL细胞,包装重组病毒r PAV3-COE和r PAV3-m COEs。病毒传代后通过CPE观察、PCR和Western blot检测证明重组病毒包装成功,并且目的蛋白得到正确表达。2.重组PAV-3的中和抗体性检测用rPAV3-COE和r PAV3-mCOEs皮下免疫小鼠,共免疫三次,每次免疫间隔2周。分别在二免后14天和三免后14天采血分离血清检测诱导中和抗体水平,分析筛选可诱导高效中和抗体的COE突变体。检测中和抗体结果表明,表达野生型COE的重组病毒免疫小鼠后,有一半小鼠中和抗体效价低于1:16,高频突变型重组病毒PAV3-KB3-B2-530L、PAV3-KB3-B2-536V、PAV3-KB3-B2-558T、PAV3-KB3-B2-572N、PAV3-KB3-B2-614A、PAV3-KB3-B2-639K免疫小鼠后有一半以上小鼠超过1:16,糖基化去除型重组病毒PAV3-KB3-B2-N556A,糖基化引入重组病毒的PAV3-KB3-B2-563N和PAV3-KB3-B2-621N有一半以上小鼠中和抗体效价大于1:16。