肺癌是发病率和死亡率较高的恶性肿瘤。由于肺癌早期起病隐匿,大部分患者被诊断时多处于中晚期,易错过最佳治疗时期,五年生存率较低,提高肺癌的诊断率至关重要。目前,临床诊断肺癌的方法主要有组织细胞学、影像学及血清肿瘤标志物检查。随着对肿瘤发病机制的研究深入,DNA甲基化在肿瘤发生发展中的作用机制备受关注,其中基因组低甲基化和CpG岛局部高甲基化可通过介导肿瘤相关基因功能改变诱发肿瘤。人矮小同源盒基因2(short stature homeobox 2,SHOX2)属于SHOX基因家族成员,主要编码蛋白转录因子,该基因表达异常或表观遗传学改变可引起某些疾病。许多研究表明SHOX2基因甲基化与肺癌有关。目前SHOX2基因甲基化检测主要借助组织活检,这种方法具有侵入性、风险较大且获取的肿瘤组织有异质性,而选用液体活检,对血液或其它体液标本进行SHOX2基因甲基化检测可弥补组织活检的缺陷。通常用于SHOX2基因甲基化检测的方法有甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序和荧光定量PCR。这些方法虽然有较好的灵敏性和特异性,但仍存在一些不足,例如不易从复杂样品中准确地定量微量的靶核酸。近年来,新型的微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术则能解决这些不足,能从复杂样本中检测到极其微量的靶核酸并进行绝对定量,灵敏性和精确性高。但是,关于在外周血中使用ddPCR检测SHOX2基因甲基化并用于肺癌诊断及疗效评估的研究,尚未见国内外文献报道。因此,本研究采用ddPCR检测SHOX2基因甲基化,分析肺癌患者外周血SHOX2基因甲基化的应用价值,为肺癌的诊疗提供一个有价值的非侵入性辅助指标。方法1.标本收集与分组:标本来自2017年7月-2019年2月在郑州大学第一附属医院就诊的肺癌患者、良性肺疾病患者和健康体检者。(1)收集100例肺癌患者治疗前外周血标本作为肺癌组,50例良性肺疾病患者和50例健康体检者外周血标本分别作为良性肺疾病组和正常组。(2)同时收集肺癌组中40例肺癌患者癌组织标本作为肺癌组织组。(3)收集肺癌组中经化疗药物联合(吉西他滨+顺铂,贝伐珠单抗联合TC方案,紫杉醇+卡铂,培美曲塞+顺铂,长春瑞滨+顺铂)治疗一个疗程前后的33例非小细胞肺癌患者外周血,参照实体瘤的疗效评价标准(RECIST)进行疗效评估,分为治疗有效组(CR和PR)与无效组(SD和PD)。2.微滴数字PCR(ddPCR)检测SHOX2基因甲基化方法优化及确立:针对SHOX2基因启动子设计特异性引物和探针;选择温度范围50℃~60℃,使用热循环仪梯度程序扩增,根据荧光振幅分离度确定ddPCR最适退火温度;以最适退火温度,用ddPCR检测甲基化和非甲基化对照品,对扩增产物进行电泳和测序;按一定比例将人完全甲基化与完全非甲基化标准品混合配制成不同甲基化水平的标准品(100%,20%,4%,0.8%,0.16%,0.032%,0.006%,0%),ddPCR进行检测并分析灵敏度。3.使用上述确立的ddPCR方法检测肺癌组织和外周血SHOX2基因甲基化。4.采用电化学发光免疫分析技术测定血清肿瘤标志物CEA、NSE、CA125和CYFRA21-1水平。5.使用SPSS 19.0软件分析数据。两组间SHOX2基因甲基化阳性率比较采用χ~2检验;SHOX2基因甲基化和肿瘤标志物的临床价值通过受试者操作特性(receiver operating characteristics,ROC)曲线分析;Pearsonχ~2独立性检验分析SHOX2基因甲基化状态与临床病理特征关系;治疗前后组间比较采用Wilcoxon符号秩检验。检验水准α=0.05,P<0.05有统计学意义。结果1.检测SHOX2基因甲基化的ddPCR方法优化及确立:在50℃~60℃之间,荧光信号强度先增强后减弱,当温度在56.3℃~58.3℃范围时,阳性微滴和阴性微滴分离较明显,为了提高结果特异性,选择58℃为ddPCR检测SHOX2基因甲基化的最适退火温度;以58℃作为退火温度,采用ddPCR方法检测甲基化和非甲基化对照品中SHOX2基因甲基化,扩增产物电泳及测序结果与预期结果一致;通过检测不同甲基化水平标准品,结果发现在100%,20%,4%,0.8%和0.16%甲基化标准品中可检测出SHOX2基因甲基化阳性,而在0.032%,0.006%和0%甲基化标准品中未测出,这表明本研究建立的检测SHOX2基因甲基化的ddPCR方法灵敏度为0.16%。2.外周血代替肺癌组织检测SHOX2基因甲基化比较分析:肺癌组织组和对应外周血组中SHOX2基因甲基化阳性率分别为47.5%(19/40)和40%(16/40),两组SHOX2基因甲基化阳性率无明显差异(χ~2=0.8,P=0.375)。3.ddPCR检测肺癌患者外周血SHOX2基因甲基化临界值确定及临床应用价值分析:ROC曲线分析肺癌组(III和IV期患者)和正常组的SHOX2基因甲基化水平,结合尤登指数(Youden index)发现以Ratio值0.64作为临界值时诊断肺癌敏感性和特异性最好,因此,选用0.64作为临界值以区分SHOX2基因甲基化阳性和阴性;此时,肺癌组SHOX2基因甲基化阳性率为68.0%(68/100),良性肺疾病组SHOX2基因甲基化阳性率为8.0%(4/50),差异有统计学意义(χ~2=48.077,P<0.0001),ROC分析结果显示AUC值为0.838。4.SHOX2基因甲基化联合血清肿瘤标志物检测在肺癌中的临床应用价值:经ROC曲线分析,CEA、NSE、CA125和CYFRA21-1的AUC值分别为0.735、0.663、0.631和0.862(均P<0.05);SHOX2基因甲基化联合四项指标(CEA、NSE、CA125和CYFRA21-1)检测的AUC值为0.929,高于这四项指标联合的AUC值0.893(P=0.041)。SHOX2基因甲基化与CEA、NSE、CA125、CYFRA21-1水平有相关性,相关系数(R)分别为0.355、0.216、0.261和0.533(均P<0.05),其中SHOX2基因甲基化与CYFRA21-1水平显著性相关(P<0.0001)。5.SHOX2基因甲基化与肺癌患者临床病理特征的关联性:肺癌患者外周血SHOX2基因甲基化状态与年龄、性别、吸烟状况(有和无)无关(P=0.798,P=0.808,P=0.320)。与组织类型和TNM分期有关(P=0.019,P=0.009),其中小细胞肺癌患者SHOX2基因甲基化阳性率为85.7%(18/21),依次肺鳞癌75.8%(25/33)和肺腺癌54.3%(25/46);IV期肺癌患者SHOX2基因甲基化阳性率为86.4%(19/22),其次III期77.4%(24/31)、II期65.0%(13/20)、I期44.4%(12/27)。6.非小细胞肺癌患者治疗一个疗程前后外周血SHOX2基因甲基化水平对比分析:非小细胞肺癌患者经化疗药物联合治疗一个疗程后发现,治疗有效组8例,无效组25例,有效率为24.2%(8/33);治疗后的SHOX2基因甲基化水平低于治疗前,差异有统计学意义(P=0.0006)。结论1.建立了检测SHOX2基因甲基化的ddPCR方法,外周血可代替肺癌组织用于SHOX2基因甲基化的检测。2.SHOX2基因甲基化联合四项常见肿瘤标志物(CEA、CA125、NSE和CYFRA21-1)检测,提高了这四项肿瘤标志物联合检测在肺癌诊断中的临床应用价值。3.SHOX2基因甲基化参与肺癌的发生发展,可以作为肺癌诊断和疗效评估的辅助指标。