鳗弧菌是水产养殖鱼类弧菌病的主要致病菌。课题组前期使用无标记缺失技术构建了鳗弧菌减毒活疫苗MVAV6203,注射和浸泡接种大菱鲆等鱼后表现出了良好的免疫保护力。然而,该疫苗在浸泡接种后适应性免疫的激发和黏膜免疫系统的应答情况并不清楚,对病原感染后鱼体的抵御过程基本不了解。本研究中运用斑马鱼全基因组基因芯片,对浸泡接种后28天的斑马鱼脾脏进行了转录组分析,共发现了2164个差异表达的基因。经过系统分析发现,接种后的斑马鱼除了铁代谢和信号通路相关的基因发生显著变化外,B细胞和Th(辅助性T细胞)17细胞分化成熟相关的适应性免疫基因表达也发生了显著变化。采用定量PCR方法,进一步分析了浸泡接种后35天内斑马鱼脾脏Th17细胞激活、增殖和分化相关的免疫基因时相表达变化,结果显示疫苗接种后Th17细胞相关通路被显著激活。考虑到Th17相关细胞因子在黏膜部位抵抗胞外菌感染中的作用,本研究对接种鳗弧菌减毒活疫苗所诱导的Th17相关黏膜免疫应答以及免疫保护力进行了考察。用浸泡和注射方式对斑马鱼接种鳗弧菌减毒活疫苗,在接种28天后对斑马鱼进行野生株浸泡攻毒。结果显示,浸泡接种后的斑马鱼在进行浸泡攻毒时的免疫保护力比注射接种方式略高。两种接种方式下黏膜组织内免疫基因的表达分析发现,浸泡和注射接种后斑马鱼在免疫期的28天内和攻毒后的72小时内均引起了Th17相关基因的表达上调,尤其是IL(白介素)-17AF、IL.21、IL-22及防御素基因表达的显著上调,说明了两种接种方式都有效激发了斑马鱼Th17细胞样的黏膜免疫应答。浸泡接种和注射接种鳗弧菌减毒活疫苗都可以引起斑马鱼黏膜部位的Th17细胞样免疫反应,而且Th17细胞样免疫反应在野生菌MVM425浸泡攻毒过程中也被显著激活,说明其在抵抗致病菌感染过程中发挥作用。Th1和Th2细胞样免疫反应虽然分别在注射接种斑马鱼鳃部以及浸泡接种斑马鱼的鳃部和肠道被激活,但在攻毒过程中没有显著的上调表达,说明Th1和Th2细胞样免疫反应在鳗弧菌减毒活疫苗激发的保护性免疫中的作用有限。浸泡接种和接种后浸泡攻毒激发Th17细胞样黏膜免疫的主要场所是肠道和鳃,而注射接种和接种后浸泡攻毒激发Th17细胞样黏膜免疫的主要场所是鳃和皮肤。浸泡接种和接种后攻毒在斑马鱼的肠道Th17细胞相关免疫因子发生了强烈的上调表达,说明肠道在疫苗浸泡接种的斑马鱼抵抗病原感染过程中的重要性。浸泡接种和注射接种斑马鱼的鳃组织都发现Th17细胞样免疫反应。浸泡接种的斑马鱼,黏膜组织部位激发Th17细胞样免疫的时间早于注射接种,说明斑马鱼黏膜免疫可以独立于系统性免疫产生免疫应答。另外,鳗弧菌减毒活疫苗对大菱鲆的浸泡接种及攻毒分析表明,该疫苗也可使大菱鲆获得有效的免疫保护并引发大菱鲆Th17细胞样的黏膜和系统性免疫应答。大菱鲆浸泡接种和攻毒时抗体滴度的增加说明体液免疫对免疫保护也有一定的贡献。本研究对大菱鲆BLT1(白三烯B4受体)基因进行了克隆及功能研究。利用SMART RACE技术完成了大菱鲆的BLT1基因全长cDNA克隆,序列分析发现cDNA全长为1577bp,包含1119bp的开放阅读框,250bp的5’UTR和208bp的3’UTR。同源比对结果表明,大菱鲆的BLT1蛋白结构和其他鱼类类似,软件预测为7次跨膜的G蛋白偶联受体,进化树分析表明与红鳍东方鲀、青鳉亲缘关系比较近。组织表达分析发现,它在大菱鲆肾脏、脾脏两个系统免疫器官中高度表达,在黏膜组织的鳃和皮肤中都有表达,但肠中表达量较低。BLT1在鳗弧菌减毒活疫苗浸泡接种大菱鲆后7天的鳃和肠中以及接种后21天的脾脏中表达被显著上调,说明其参与大菱鲆的先天性免疫和适应性免疫应答。使用瞬时转染技术,分析了融合EGFP的BLT1在CHO细胞中的表达情况。这些结果说明BLT1蛋白是一个趋化因子受体,在响应鳗弧菌疫苗刺激的免疫应答中发挥作用。综上所述,浸泡接种鳗弧菌减毒活疫苗后激发的Th17细胞样适应性免疫和黏膜免疫在斑马鱼和大菱鲆对抗弧菌病中发挥重要的作用,大菱鲆免疫相关基因BLT1的克隆与功能鉴定为大菱鲆免疫机理的进一步研究提供基础。