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研究背景随着人们生活水平的提高,我国居民心血管疾病的发病率显著增加。血管内皮细胞是指衬于整个血管系统内表面的单层上皮细胞,它不但是血管壁与血液的天然屏障,更具有维持循环系统稳态的功能。重大的心血管疾病(如高血压、冠心病等)都与血管内皮细胞调控功能障碍和损伤相关。因此,阐明血管内皮细胞功能障碍的机制对于防治重大心血管疾病具有重要意义。RNA腺苷脱氨酶(Adenosine deaminases that act on RNA, ADAR)是能将RNA中腺苷酸(Adenosine)转变为次黄嘌呤核苷(Inosine)的RNA A-I编辑酶。ADAR1是哺乳动物细胞中具有编辑酶活性的脱氨酶之一,它已经被证明在胚胎发育、病毒感染、肿瘤的发生以及自身免疫性疾病的发生发展中起到重要作用。许多具有重要生理功能的蛋白质都受到RNA A-I编辑的调控,但目前关于ADAR1对内皮细胞功能的影响及其机制尚不明了。ADAR1基因敲除小鼠胚胎呈白色、血管样结构减少,提示ADAR1敲除影响小鼠胚胎血管发育。然而,ADAR1如何影响内皮功能缺乏深入的研究,其具体分子机制有待阐明。研究目的本课题以ADAR1为中心,试图阐明ADAR1缺失对内皮细胞功能改变的影响及其机制。我们推测内皮细胞ADAR1对于维持血管内皮稳态是不可或缺的。1.在体外利用siRNA干扰内皮细胞ADAR1表达,检测与分析内皮细胞小管形成、细胞渗透性以及内皮细胞相关功能蛋白质的表达水平,探索ADAR1对内皮细胞功能的影响及其机制。2.观察血管内皮细胞特异性ADAR1基因敲除小鼠表型,检测条件性敲除小鼠血管渗透性和血管新生功能,初步探讨ADAR1对血管内皮功能的影响,以了解ADAR1对于血管稳态维持的重要作用及其调控机制。研究方法利用ADAR1flox/flox小鼠和VE-Cadherin-Cre小鼠杂交培育生成ADAR1flox/flox,Cre/+小鼠,即内皮细胞特异性ADAR1基因敲除小鼠；ADAR1flox/flox,Cre/-小鼠作为野生型对照小鼠。体外细胞实验利用ADAR1 siRNA干扰人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)作为ADAR1基因沉默细胞模型。应用H&E染色、免疫组织化学法、免疫荧光法和透射电镜观察内皮细胞特异性ADAR1基因敲除小鼠病理学改变；应用伊文氏兰(Evans blue, EB)渗透性方法评估细胞和小鼠血管ADAR1缺失后渗透性变化；应用下肢缺血模型和主动脉环血管生成实验评价内皮细胞特异性ADAR1基因敲除小鼠血管新生功能；应用Western Blot法和细胞免疫荧光法检测ADAR1缺失后内皮细胞功能相关蛋白表达水平的变化。研究结果1.通过ADAR1 siRNA基因沉默HUVECs ADARl表达观察其对内皮细胞功能的影响。结果表明与对照siRNA相比,ADAR1 siRNA显著抑制HUVECs增殖、小管形成功能,同时显著增加细胞渗透性。2.通过免疫印迹法和免疫荧光法检测了ADAR1 siRNA对内皮细胞功能相关蛋白表达的影响。结果表明Caveolin-1在ADAR1 siRNA干预后表达显著低于对照siRNA组,而VEGFs Sprouty 2、p-eNOS和MMP-9在两组间均无显著差异。此外,ADAR1 siRNA显著抑制Caveolin家族另一亚型Caveolin-2和Caveolin-1下游蛋白VE-cadherin的表达。3.用胞膜通透的Caveolin-1类似物-Cavtratin预处理HUVECs显著缓解ADAR1 siRNA对HUVECs小管形成和细胞渗透性的损伤作用,并上调Caveolin-1下游蛋白VE-cadherin的表达。4.利用Flox/Cre系统成功培育出内皮细胞特异性ADAR1基因敲除小鼠。观察该小鼠表型发现内皮特异性ADAR1敲除会导致小鼠出生后4周内死亡75%。病理学检查各脏器发现,ADAR1内皮特异性敲除小鼠肺脏组织肺泡上皮增生,部分肺泡腔内出血,间质炎细胞浸润,肺间质增厚。而与野生型小鼠相比,颈动脉、主动脉、心脏、肝脏和肾脏均无明显改变。5.透射电镜观察肺脏内皮细胞发现ADAR1内皮特异性敲除小鼠肺血管内皮细胞细胞间间隙增宽。Evans Blue血管渗透性检测发现内皮特异性敲除ADAR1增加小鼠肺脏血管渗透性。通过免疫印迹法和免疫荧光法检测肺脏发现基因敲除小鼠肺脏Caveolin-1/VE-cadherin表达较野生型小鼠显著下降。6.通过主动脉环血管形成实验和下肢缺血模型检测小鼠血管新生功能。结果表明内皮细胞缺失ADAR1显著抑制小鼠胸主动脉血管形成;与野生型小鼠相比,内皮特异性ADAR1敲除小鼠下肢缺血后血流恢复显著抑制,并且模型组下肢肌肉缺血后血管新生明显受到抑制。结论1. ADAR1 siRNA可抑制内皮细胞小管形成和增加细胞渗透性。2. ADAR1 siRNA损伤内皮细胞功能与抑制Caveolin-1/VE-cadherin表达有关；Cavtratin可逆转ADAR1 siRNA对内皮细胞的损伤作用。3. ADAR1内皮细胞特异性敲除小鼠因肺损伤而导致小鼠出生后部分死亡。4. ADAR1内皮细胞特异性敲除可增加小鼠血管渗透性,抑制下肢缺血后血流恢复和主动脉环血管形成功能。5. ADAR1内皮细胞特异性敲除可抑制肺脏血管Caveolin-1/VE-cadherin的表达。我们在这项研究中发现ADAR1敲除增加血管渗透性、抑制血管新生同时抑制Caveolin-1/VE-cadherin的表达。本课题的完成提示ADAR1在内皮完整性和血管新生中起到重要作用,并且可能为血管内皮损伤性疾病的治疗提供新的治疗靶点。