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骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)是一种低免疫原性的多潜能干细胞,已成为在损伤组织修复和再生等组织工程研究和临床细胞治疗中应用最多的干细胞类型。然而在体外培养过程中,BMSCs极易发生复制性衰老,严重制约其在生物医学上的研究和应用。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)作为糖酵解、三羧酸循环和氧化磷酸化中关键酶的辅助因子,参与细胞的物质代谢、能量合成和损伤DNA修复等多种生理病理过程。许多研究表明,细胞衰老过程伴随细胞NAD+的减少,但外源NAD+是否可有效延缓BMSCs的衰老?其分子机制是什么?这些问题目前尚不清楚。
基于此,本文主要利用D-半乳糖(D-galactose,D-gal)构建大鼠BMSCs的衰老模型,研究外源NAD+对衰老BMSCs的影响特征,并对其中的分子机理进行初步探讨。本实验首先通过全骨髓法提取并培养大鼠BMSCs,然后检测在不同浓度外源NAD+作用下,衰老BMSCs中细胞衰老相关β-半乳糖苷酶(Senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal)表达、细胞活力及活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的变化情况。在此基础上进一步检测了外源NAD+对衰老BMSCs中去乙酰化酶1(Sirtuin1,Sirt1)、聚ADP-核糖聚合酶1(Poly(ADP-ribose)polymerase1,PARP1)、CD38及P53表达的影响。最后通过小干扰RNA(Small interfering RNA,si-RNA)敲减Sirt1的表达,探究了Sirt1在外源NAD+影响BMSCs衰老过程中的关键作用。
实验结果显示,10g/L D-gal能够显著增加BMSCs中SA-β-gal染色阳性率,并降低BMSCs的细胞活力,提示已成功构建BMSCs的衰老模型。在此基础上,使用不同浓度外源NAD+处理衰老BMSCs,SA-β-gal染色和CCK-8分析结果显示,外源NAD+显著降低衰老BMSCs中SA-β-gal染色阳性率,并增加衰老BMSCs的细胞活力,表明外源NAD+对延缓BMSCs衰老具有积极作用。进一步的研究发现,外源NAD+显著增加衰老BMSCs中NAD+水平及NAD+/NADH比例,降低细胞中ROS的生成。Western blot结果证实了外源NAD+显著上调衰老BMSCs中Sirt1的表达,抑制PARP1、CD38和P53的表达。接下来通过si-RNA敲减衰老BMSCs中Sirt1的表达,对Sirt1在外源NAD+延缓BMSCs衰老中的作用进行分析。结果显示,敲减Sirt1的表达显著上调衰老BMSCs中PARP1、CD38和P53的表达,而外源NAD+显著抑制衰老BMSCs中这三个分子的表达,然而与未敲减Sirt1的衰老BMSCs相比,外源NAD+对PARP1、CD38和P53的抑制作用被减弱,表明在衰老BMSCs中,外源NAD+通过调节Sirt1的表达,调控PARP1、CD38和P53的表达。SA-β-gal染色和流式细胞术及CCK-8分析结果显示,敲减BMSCs中Sirt1的表达显著增加BMSCs中SA-β-gal染色阳性率和细胞内ROS水平,降低BMSCs细胞活力,促进BMSCs衰老。补充外源NAD+后,衰老BMSCs中SA-β-gal染色阳性率和ROS水平降低,BMSCs细胞活力增加,但是与未敲减Sirt1的BMSCs相比,外源NAD+延缓BMSCs衰老的作用被减弱。这些结果表明,Sirt1在外源NAD+延缓BMSCs衰老的过程中具有重要作用。
综上所述,本研究证明了外源NAD+能有效抑制BMSCs的衰老,Sirt1分子在此过程中起重要的信号介导作用。该研究结果为NAD+在抗细胞衰老领域的广泛应用和体外获取高质量BMSCs及其更好临床应用提供了理论基础和方法学参考。
基于此,本文主要利用D-半乳糖(D-galactose,D-gal)构建大鼠BMSCs的衰老模型,研究外源NAD+对衰老BMSCs的影响特征,并对其中的分子机理进行初步探讨。本实验首先通过全骨髓法提取并培养大鼠BMSCs,然后检测在不同浓度外源NAD+作用下,衰老BMSCs中细胞衰老相关β-半乳糖苷酶(Senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal)表达、细胞活力及活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的变化情况。在此基础上进一步检测了外源NAD+对衰老BMSCs中去乙酰化酶1(Sirtuin1,Sirt1)、聚ADP-核糖聚合酶1(Poly(ADP-ribose)polymerase1,PARP1)、CD38及P53表达的影响。最后通过小干扰RNA(Small interfering RNA,si-RNA)敲减Sirt1的表达,探究了Sirt1在外源NAD+影响BMSCs衰老过程中的关键作用。
实验结果显示,10g/L D-gal能够显著增加BMSCs中SA-β-gal染色阳性率,并降低BMSCs的细胞活力,提示已成功构建BMSCs的衰老模型。在此基础上,使用不同浓度外源NAD+处理衰老BMSCs,SA-β-gal染色和CCK-8分析结果显示,外源NAD+显著降低衰老BMSCs中SA-β-gal染色阳性率,并增加衰老BMSCs的细胞活力,表明外源NAD+对延缓BMSCs衰老具有积极作用。进一步的研究发现,外源NAD+显著增加衰老BMSCs中NAD+水平及NAD+/NADH比例,降低细胞中ROS的生成。Western blot结果证实了外源NAD+显著上调衰老BMSCs中Sirt1的表达,抑制PARP1、CD38和P53的表达。接下来通过si-RNA敲减衰老BMSCs中Sirt1的表达,对Sirt1在外源NAD+延缓BMSCs衰老中的作用进行分析。结果显示,敲减Sirt1的表达显著上调衰老BMSCs中PARP1、CD38和P53的表达,而外源NAD+显著抑制衰老BMSCs中这三个分子的表达,然而与未敲减Sirt1的衰老BMSCs相比,外源NAD+对PARP1、CD38和P53的抑制作用被减弱,表明在衰老BMSCs中,外源NAD+通过调节Sirt1的表达,调控PARP1、CD38和P53的表达。SA-β-gal染色和流式细胞术及CCK-8分析结果显示,敲减BMSCs中Sirt1的表达显著增加BMSCs中SA-β-gal染色阳性率和细胞内ROS水平,降低BMSCs细胞活力,促进BMSCs衰老。补充外源NAD+后,衰老BMSCs中SA-β-gal染色阳性率和ROS水平降低,BMSCs细胞活力增加,但是与未敲减Sirt1的BMSCs相比,外源NAD+延缓BMSCs衰老的作用被减弱。这些结果表明,Sirt1在外源NAD+延缓BMSCs衰老的过程中具有重要作用。
综上所述,本研究证明了外源NAD+能有效抑制BMSCs的衰老,Sirt1分子在此过程中起重要的信号介导作用。该研究结果为NAD+在抗细胞衰老领域的广泛应用和体外获取高质量BMSCs及其更好临床应用提供了理论基础和方法学参考。