近年来在畜牧养殖业中由于抗生素的不合理使用致使耐药性和药物残留等问题日益严峻。因此研发出无污染、无残留并能有效促进畜禽健康的抗菌肽和微生态制剂等抗生素替代品,均有望在无抗日粮的配合技术中发挥重要作用。牛乳铁蛋白肽是牛乳铁蛋白（Lactoferrin bovine,LFB）在胃蛋白酶水解条件下得到的一种抗菌肽,同时具有抗病毒和免疫调节等多种生物学功能。罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri,LR）是动物肠道内的一种益生菌,常做为饲料添加剂使用,同时它作为外源蛋白表达载体的研究也备受关注。本实验室前期利用猪源罗伊氏乳杆菌作为载体,成功构建了表达牛乳铁蛋白肽的重组菌p PG-LFCA-E/LR-CO21,可以同时兼具乳酸菌和抗菌肽的益生特性。但目前该体系蛋白表达量还有待提高。本研究以高密度发酵工艺优化重组菌培养条件为切入点来提高罗伊氏乳杆菌生物量及牛乳铁蛋白肽表达量,并在体外通过抑菌实验测定优化后重组菌表达的牛乳铁蛋白肽的抑菌活性。为了检测重组菌增强仔猪抗病作用的效果,评价了其对脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导的断奶仔猪肠道炎症的保护作用,为其作为促进仔猪肠道健康的微生态制剂应用于生产实践提供理论依据。以重组菌p PG-LFCA-E/LR-CO21的菌体生物量与目的蛋白LFCA的浓度为响应值,首先利用单因素实验筛选出了接种量,p H,温度,溶氧,转速五个影响因素的最优值,接着通过Plackett-Burman（PB）实验设计得到p H,温度,溶氧三个主要影响因素,最后利用响应面设计实验确定最优培养条件为:以2%的接种量,发酵参数为温度36.5℃,溶氧9%,转速200 r/min,并用25%（w/v）的氨水维持发酵液p H=6,以10 m L/h流加50%的葡萄糖,发酵10 h时,菌体密度OD600约为10.7230,比未优化提高了55%,优化后重组菌分泌表达到上清中的牛乳铁蛋白肽含量从1.31 mg/L提高到19.58 mg/L,提高了13.94倍,成功实现牛乳铁蛋白肽在罗伊氏乳杆菌中的高效表达。接着将优化前后菌液在同菌体密度、同处理方法情况下,利用微量肉汤稀释法测定了50%最小抑菌浓度,利用牛津杯法测定抑菌圈直径和抑菌率,结果发现,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,优化后重组菌上清液的抑菌圈直径及抑菌率都相应地提升,其中对大肠杆菌CVCC10141株的抑菌率提高了12.82%,对金黄色葡萄球菌ATCC43300株的抑菌率提高了7.98%。为进一步检测重组菌对LPS诱导仔猪肠道炎症的保护效果,通过实验室前期已建立的LPS仔猪炎症模型,确定LPS感染剂量为100μg/kg体重（BW）,选取12头体重相近、健康状况良好的断奶仔猪为实验动物,随机分为3组,每组4头重复,三组分别为（1）空白对照组（CON）:基础日粮;（2）LPS模型对照组（LPS）:基础日粮;（3）重组菌组（LR-LFCA+LPS）:基础日粮+重组菌菌液(添加量为1×1011 CFU/kg日粮,饲喂时间10 d)。实验周期21 d,记录仔猪采食量。在实验最后一天,LPS组和LR-LFCA组的猪腹腔注LPS,4 h后采血,称重,然后屠宰采集空肠、回肠及结肠组织。分析血常规指标变化,血清和肠组织中免疫相关分子表达情况以及肠黏膜组织受损程度。结果表明在LR-LFCA组日增重相比于CON组和LPS组显著提高（P＜0.05）,达到531±13.04 g/d。LR-LFCA降低了LPS造成的急性腹泻比例,腹泻率仅是LPS组的46%。血常规指标结果显示LR-LFCA组显著调节LPS组各指标的异常变化（P＜0.01）,使参数趋于恢复至正常范围内。LR-LFCA组仔猪血清内总Ig G和Ig M抗体水平明显上升,肠黏膜s Ig A的分泌水平相比对照组无显著性差异（P＞0.05）,使仔猪肠道的免疫球蛋白数量处于一个相对稳定的水平。LR-LFCA缓解了因感染LPS后空肠和回肠肠黏膜促炎因子IL-1β,L-6和TNF-α的表达增加,同时提高了抑炎因子IL-10的表达水平。从肠道屏障机能上看,LR-LFCA组显著上调了紧密连接蛋白Occludin和ZO-1在小肠组织中的转录水平（P＜0.01）。另外LR-LFCA组缓解了肠绒毛损伤及中性粒细胞浸润等炎性变化。以上结果表明通过在饲料中添加重组菌LR-LFCA可以缓解仔猪由于LPS感染导致的体重下降以及腹泻率升高,同时恢复血液生理指标,调控炎症因子的表达与释放,提高免疫球蛋白水平,改善肠绒毛破损,增强肠屏障功能的完整性。综上所述,通过优化发酵工艺获得了表达牛乳铁蛋白肽的重组罗伊氏乳杆菌最佳菌体生物量和蛋白表达量;将发酵后的重组菌饲喂仔猪,对LPS诱导的仔猪肠道炎症起到一定的保护作用。本研究为推进新型微生态制剂在猪养殖生产中的应用提供了基础。