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流感是一种具有高度传染性的疾病,甲型H1N1流感病毒pdm09自2009年初次出现以来,共造成全世界约575400人死亡,给人类生命健康带来巨大的威胁。鼻腔是流感病毒入侵机体的主要部位,如果在鼻腔建立良好的黏膜免疫,则可以第一时间有效地阻断病毒的感染。鼻腔免疫全灭活病毒(Whole inactivated virus,WIV)疫苗是一种预防流感病毒感染的有效措施,但是单独的灭活病毒免疫效果并不理想。氧化铁纳米酶(Iron oxide nanozymes,IONzymes)可模拟多种类酶活性,如过氧化物酶(peroxidase,POD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)活性等。在pH酸性条件下,IONzyme表现出类过氧化物酶(peroxidase,POD)活性,有利于胞内活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)的产生,该特点有助于树突状细胞(Dendritic cells,DCs)成熟,提高天然免疫水平。此外,对IONzymes表面参杂壳聚糖(chitosan,CS)可提高其类酶活性,同时改变表面电荷,有利于提高抗原递送效率,因此推测壳聚糖修饰纳米酶(CS-IONzyme)可能是一种新型黏膜疫苗佐剂。本研究首先评估CS-IONzyme-H1N1流感黏膜疫苗的黏膜递送能力。其次,体外评价CS-IONzyme对小鼠DCs天然免疫应答水平的影响。最后,通过小鼠免疫和攻毒试验,评价该疫苗的免疫保护效率,为CS-IONzyme作为鼻腔黏膜免疫佐剂的应用提供理论依据。研究内容主要分为以下三个部分:1、CS-IONzyme对H1N1 WIV黏附鼻腔上皮细胞和DCs募集的影响本试验应用水热法合成了 CS-IONzyme,并与H1N1 WIV吸附连接,制备H1N1 WIV-CS-IONzyme流感黏膜疫苗,并对小鼠进行滴鼻免疫试验。采集鼻腔进行免疫荧光试验及共聚焦显微镜观察发现,与单独抗原组相比,CS-IONzyme能够显著增加H1N1 WIV的黏膜递送数量和黏附时间并在鼻腔黏膜下招募了大量的DCs聚集,这些DCs可以伸出跨上皮树突(transepithelial dendrites,TEDs)摄取腔外黏附的H1N1 WIV粒子。通过流式细胞术及门控策略进一步对鼻腔细胞悬液分析发现,CS-IONzyme可以上调鼻腔黏膜上皮细胞的CCL20、TLR2和TLR4的表达水平,使用TLR2和TLR4抑制剂后,鼻黏膜上皮的CCL20表达水平和黏膜下DCs的数量显著下降。上述结果表明,CS-IONzyme通过TLR2/4信号通路诱导鼻腔黏膜上皮细胞表达趋化因子CCL20,招募DCs至鼻黏膜下方,通过TEDs摄取H1N1 WIV。2、CS-IONzyme对小鼠DCs天然免疫应答水平的影响为了探讨CS-IONzyme对小鼠DCs天然免疫应答水平的影响,本试验将CS-IONzyme与小鼠原代DCs共孵育24 h后,收集DCs及细胞上清液,检测DCs表型标志、细胞因子的分泌、吞噬FITC-Dextran、刺激CD4+T细胞增殖和ROS水平。结果显示,与对照组相比,CS-IONzyme显著增强DCs表面标志CD80、CD86、CD40和MHCⅡ的表达;同时促进细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-12p70、IL-6和IL-10的分泌;抑制吞噬FITC-Dextran能力;在混合淋巴细胞反应试验中,显著刺激CD4+T细胞的增殖;促进DCs胞内ROS的产生。此外,使用ROS抑制剂后,DCs表型标志CD40和MHCⅡ的表达显著下降,细胞因子的分泌(TNF-α、IL-1β、IL-12p70、IL-6和IL-10)显著下降,上述结果表明,CS-IONzyme通过ROS通路增强DCs天然免疫应答水平。3、H1N1 WIV-CS-IONzyme鼻腔黏膜递送疫苗的免疫保护效力评价小鼠鼻腔免疫H1N1 WIV-CS-IONzyme疫苗,28 d后,鼻腔感染106 EID50的H1N1流感病毒,监测小鼠体重和存活率,观察第5 d和第7 d肺脏病变,检测第5 d肺脏中病毒载量。结果显示,与H1N1 WIV(存活率30%)组对比,H1N1 WIV-CS-IONzyme组可完全抵抗H1N1流感病毒的致死性攻击(存活率100%),体重影响较小;第5 d和第7 d脏器病变和组织切片观察,发现H1N1 WIV-CS-IONzyme组肺脏未见明显病变;通过EID50滴定法测定脏器中病毒载量,发现H1N1 WIV-CS-IONzyme组肺脏中病毒载量显著低于单独病毒疫苗组。上述结果表明,H1N1 WIV-CS-IONzyme鼻腔黏膜递送疫苗,可以显著提高对小鼠的保护。