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目的:MicroRNA(miRNA)是一类小型非编码RNA,由大约22个核苷酸组成,其由染色体DNA编码,在转录后水平发挥调控基因表达的功能。越来越多的研究发现,miRNA具有调节胚胎发育、细胞增殖、分化、凋亡和肿瘤发生等生物学功能,miRNA主要通过与靶mRNA的3’UTR (3’非翻译区)完全或不完全的碱基互补结合,以实现其负性调节靶mRNA的功能,进而调节基因的表达。MiRNA在基因上的结合位点单核苷酸多态性(SNP)与人类肿瘤发生关系密切,但关于miRNA结合位点SNP与原发性肝癌关系的研究甚少。本研究拟通过对与肿瘤密切相关的miRNA结合位点SNP进行测序分析,并随访相应原发性肝癌患者,进行生存分析,结合病例-对照研究,鉴定出与肝癌发生及预后相关的特异SNP位点,对分析探讨个体和肿瘤易感因素的关系,筛查易患肝癌的高危人群,以及进行预后的评价,建立有效的预警机制均具有重要意义。方法:1研究对象:肝癌组患者为2007年9月~2008年3月间,在河北医科大学第四医院肝胆外科住院的手术患者,经实验室及影像学等检查,临床诊断为原发性肝癌,行原发性肝癌根治手术,所有患者皆经术后病理明确诊断为肝细胞癌,肝癌组60例原发性肝细胞肝癌的标本,均取自手术切除的肿瘤组织;对照组60例抗凝静脉血标本,均来自2008年10月~2009年4月间,在河北医科大学第四医院采集的正常人静脉血样。2基因组DNA提取:用DNA纯化试剂盒提取组织及血标本的基因组DNA,提取后置于4℃恒温冰箱中保存备用。3 PCR (polymerase chain reaction)扩增miRNA结合位点目的片段:在NCBI数据库中查找与12个miRNA结合的SNP位点对应的目的基因,设计PCR扩增引物,用PCR预混试剂盒(无色体系)进行扩增,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳证实后,送往上海生物工程技术服务有限公司测序。4随访:通过电话随访原发性肝癌患者术后的生存情况。5统计分析:采用t检验比较计量资料,用χ2检验分析肝癌组与对照组的SNP分布频率,采用Kaplan-Meier方法估计组间生存率和绘制累计生存函数曲线,用Log-Rank方法对各组生存曲线分布的异同进行检验,比较生存率有无差别。所有数据分析应用SPSS10.0统计软件,P<0.05被认为有统计学意义。结果:对与miRNA在基因上结合的12个SNP位点目的片段进行扩增并测序,发现rs12583、rs1128665、rs17703261、rs14109、rs17107469、rs10463六个多态性位点,低频率等位基因出现率极小,测序结果显示其基因型单一,不适宜进行相关分析,因此筛选出rs1044129a、rs4901706、rs16917496、rs1053667、rs11337、rs3660六个多态性位点进行随后的研究。1对与miRNA在基因上结合的6个位点的SNP分布频率分析显示,在肝癌组和对照组之间,rs16917496、rs1053667、rs11337、rs3660多态性位点各组间比较,发现此四个位点SNP分布频率无明显差异。而对于RYR3基因的多态位点rs1044129a,A/A、A/G基因型频率存在差异(χ2=5.562,P=0.018),A/A、A/G+G/G基因型频率存在差异(χ2=4.261,P=0.039);对于C14orf101基因的多态位点rs4901706,G/G、A/G基因型频率存在差异(χ2=5.022,P=0.025),G/G、A/G+A/A基因型频率存在差异(χ2=5.647,P=0.017),G、A等位基因型频率存在差异(χ2=4.843,P=0.028)。以上结果说明,RYR3基因的rs1044129a位点和C14orf101基因的rs4901706位点的SNP分布频率存在差异,其与原发性肝癌发生相关。2对与miRNA在基因上结合的6个SNP位点,各基因型原发性肝癌患者的生存率进行分析,rs1044129a、rs4901706、rs16917496、rs11337、rs3660五个多态位点,各基因型患者组间生存率无明显差别。而对于KIAA0423基因的多态位点rs1053667,T/T(38)、C/T(15)、C/C(3)基因型患者的2年生存率分别为44.74%、40.00%、0.00%,其中T/T、C/C基因型患者两组间生存率有差别(P=0.0054)。结合生存函数曲线分析,和其他基因型比较,C/C基因型患者生存期最短,C/C基因型与患者生存率呈负相关,C等位基因可能为控制遗传、影响原发性肝癌患者生存率的隐性基因。以上结果说明,KIAA0423基因的rs1053667位点SNP与原发性肝癌预后相关。结论:1在肝癌组与对照组之间,RYR3基因的多态位点rs1044129a的SNP和C14orf101基因的多态位点rs4901706的SNP分布频率存在差异,此两个位点可能是与原发性肝癌发生相关的SNP位点。2对于KIAA0423基因的多态位点rs1053667,T/T、C/C基因型患者生存率有差别,C/C基因型患者生存期最短,并与患者生存率呈负相关,该位点C等位基因可能为控制遗传、影响原发性肝癌患者生存率的隐性基因,rs1053667位点可能为影响原发性肝癌预后的相关SNP位点。