论文部分内容阅读
枯萎病(Fusarium oxyporum f.sp.niveum(E.F.Smith)Snyder&Hansen,FON)是威胁西瓜(Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum&Nakai)生产的主要土传病害之一。西瓜多年的连续种植会导致西瓜枯萎病病害发生严重,果实品质,产量严重下降,已成为限制西瓜生产的瓶颈问题。探索寻找合理的农艺措施是缓解西瓜枯萎病的有效手段,前期研究结果发现,小麦伴生西瓜能有效的缓解西瓜枯萎病的发生,并能提高西瓜的抗性,但小麦伴生西瓜提高西瓜抗性的机理不明。本研究以小麦和西瓜为试材,运用活性示踪的方法,利用萃取,柱层析结合TLC板和UPLC-Q-TOF-MS技术逐步对小麦根系分泌物中的抑菌物质进行了分离、鉴定,并检测了抑菌物质在小麦根际土中的浓度和土壤中的半衰期;利用组培和植物-土壤反馈实验,分别研究了小麦根系分泌物和小麦伴生西瓜后土壤微生物对西瓜抗性的影响;利用体外实验,研究了小麦根系分泌物对西瓜枯萎病原菌的致病力的影响;揭示了伴生小麦提高西瓜枯萎病抗性的机理,为小麦与西瓜伴生栽培模式的应用及其相关研究提供理论依据和技术支撑。本研究的主要结果如下:(1)单作和伴生小麦的根系分泌物对西瓜枯萎病菌丝生长均有显著的抑制作用(p<0.05),而且单作小麦和伴生小麦根系分泌物的抑菌效果差异不显著;单作小麦根系分泌物显著抑制了西瓜枯萎菌的孢子萌发,伴生小麦后的小麦根系分泌物对西瓜枯萎病的孢子萌发无影响,这说明小麦根系分泌物通过抑制西瓜枯萎菌的菌丝生长缓解了西瓜枯萎病的发生。单作和伴生的西瓜根系分泌物对西瓜枯萎病菌丝生长无影响,而伴生西瓜的根系分泌物对西瓜枯萎菌孢子萌发具有抑制作用,说明伴生改变了西瓜根系分泌物的成分。(2)用不同极性有机溶剂萃取小麦根系分泌物的冻干粉,发现乙醚相的抑菌效果最好,采用TLC薄层层析板对乙醚相的物质进行展开剂的筛选,以正已烷:乙酸乙酯=3:1为展开剂的分离效果最佳。利用TLC板对乙醚相进行爬板分离,发现D0号物质抑菌效果最好,利用UPLC-Q-TOF-MS对0号物质进行分析,共分离鉴定出15个物质,其中有2个酰胺类,1个糖类,2个酚酸类,10个长链脂肪醇类,醇类主要为鞘氨醇。体外实验显示,随着鞘氨醇浓度的增加对FON的抑菌效果越明显,浓度达到8μm时抑菌效果达到最大,随着添加浓度的增加抑菌率反而降低。(3)组培试验研究表明,接菌前后,伴生小麦处理显著提高了抗病相关基因ClPDF2.1和ClPDF2.4基因的表达,而PAL和CHI基因的表达差异不显著;接菌后12 h,伴生小麦处理显著增加了西瓜根系木质素和总酚的含量,同时也增加了根系β-1,3-葡聚糖酶的活性;外源添加小麦根系分泌物与伴生小麦结果相似,外源添加小麦根系分泌物处理显著提高了抗病相关基因的表达;同时在接菌前后24 h,外源添加小麦根系分泌物显著增加了西瓜根系木质素和总酚的含量和β-1,3-葡聚糖酶的活性。说明小麦根系分泌物主要通过提高与植保素相关的抗性基因表达,以及提高木质素和总酚含量和β-1,3-葡聚糖酶防御酶活性,进而提高了西瓜对枯萎菌的抗性。(4)植物-土壤反馈试验显示,接种伴生小麦土壤处理显著降低了西瓜枯萎病的病情指数和发病率;接种灭菌的伴生小麦土壤处理与接种灭菌的单作西瓜土壤处理的西瓜枯萎病的病情指数和发病率无显著差异;接种伴生小麦土壤处理显著提高了西瓜抗病相关基因ClPDF2.1和ClPDF2.4基因的表达,同时显著提高木质素合成相关基因的表达;接种伴生小麦土壤处理增加了西瓜根系木质素和总酚的含量和β-1,3-葡聚糖酶的活性。结果说明伴生小麦后的土壤减轻了西瓜枯萎病并提高了西瓜对枯萎菌的抗性与土壤微生物密切相关。(5)随着外源添加小麦根系分泌物浓度的增加,西瓜枯萎菌产生FA的能力受到抑制;小麦根系分泌物有效的降低了西瓜枯萎菌胞内酶和胞外酶蛋白酶的活性,减缓了病原菌对寄主蛋白的分解速度;小麦根系分泌物处理提高了FON自噬基因的表达,加速了细胞自身的降解,同时降低了细胞壁合成基因CHI和SIX6基因的表达;总之外源添加小麦根系分泌物可以通过降低枯萎菌的产FA量和胞内细胞壁降解酶,以及提高枯萎菌自噬基因的表达来降低西瓜枯萎菌的致病力,减缓入侵宿主的速度。综上所述,伴生小麦调控西瓜对枯萎病的抗性主要通过根系分泌物和土壤微生物两个途径实现的。伴生小麦通过分泌抑菌物质来抑制西瓜枯萎病病原菌的生长,降低尖孢镰刀菌的致病力,间接增强了西瓜对枯萎菌的抗性;小麦根系分泌物和小麦伴生西瓜后的土壤微生物调控了西瓜根系抗性相关的基因(木质素生物合成和植保素基因)的表达,提高了木质素、总酚的含量和β-1,3-葡聚糖酶防御酶活性等分子和生理水平的一系列抗性响应,提高了西瓜对枯萎病的抗性,缓解了西瓜枯萎病的发生。