连接依赖循环信号放大法灵敏检测DNA甲基转移酶活性

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基因组DNA甲基化(DNA methylation)是重要的表观遗传修饰,在调节基因转录,染色质结构,胚胎发育和细胞衰老等方面发挥着至关重要的作用。精确量化DNA甲基化不仅对早期疾病诊断、预后和治疗起着关键作用,对生化研究和新药物研发也具有十分重要的意义。DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,简称DNA MTase)负责DNA甲基化的修饰,异常的DNA MTase活性可能会破坏正常的DNA甲基化模式,进而诱发包括肺癌、乳腺癌、肝癌等在内的多种癌症。目前用于DNA MTase测定的传统方法通常繁琐费力且灵敏度较低。除此之外很多人还采用一些信号扩增策略来提高检测灵敏度,但是由于非特异性扩增导致检测特异性较差,因此灵敏度并没有得到很大的提高。所以开发准确而灵敏的DNA MTase检测方法对于了解癌症发生机制和发现抗癌药物至关重要。在本论文中,我们首次开发了一种基于单核糖核苷酸修复介导的连接依赖循环信号放大的新荧光方法高灵敏地检测DNA MTase的活性。选用的核糖核酸酶(Ribonuclease HII,简称RNase HII)可以切除单个核糖核苷酸,导致信号探针的循环切割并产生增强的荧光信号。利用RNase HII酶催化的单核糖核苷酸切除的高特异性和连接依赖性循环SDA的高扩增效率的集中优势,该测定方法具有迄今为止Dam MTase检测的最高灵敏度,检测限低至4.8×10-6 U/mL,具有高达5个数量级的动态变化范围。此外,这种方法可用于从其他DNA MTase中鉴别Dam MTase,可以在大肠杆菌细胞中准确定量Dam MTase的活性,并能筛选出Dam MTase的抑制剂。本论文开发的高灵敏高特异性DNA MTase检测方法在癌症发生机制研究和抗癌药物研发中具有潜在应用价值。
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