研究背景和目的白藜芦醇（Resveratrol，3，4，5′-三羟基-反-均二苯代乙烯）是广泛存在于植物中的一种多酚类化合物，具有抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集、保护心血管、抗肿瘤等作用。近年来的研究表明：白藜芦醇对多种肿瘤细胞具有诱导凋亡的作用并对凋亡过程中的多个环节发挥作用，如：抑制iNOS表达，抑制细胞色素P450 1A1的转录，PKC磷酸化；直接以剂量和时间依赖方式阻断肿瘤坏死因子TNF诱导的核转录因子NF-kappaB的活化；由细胞外信号调节的蛋白激酶（ERK）和p38激酶使p53蛋白第15位上的丝氨酸酸化而诱导的p53的活化和凋亡等。但迄今为止，对其抗癌作用及其诱导细胞凋亡的分子机制还有许多有待揭示之处，尤其是对肝癌的作用。线粒体曾一度被认为是细胞的“能量工厂”，其主要功能是为细胞提供各种功能活动所需要的能量。除此以外，近年来人们认识到线粒体还具有其他一些重要的功能，其中线粒体在细胞凋亡中的关键作用已成为研究热点。细胞凋亡过程中许多重要事件的发生都与线粒体密切相关，包括caspase激活因子的释放，如细胞色素C（cytochrome c，Cyt．c）、电子传递链的改变、线粒体膜电位（△Ψm）的丧失、细胞内氧化还原状态的改变、Bcl-2家族促进和抑制凋亡蛋白的参与等。不同信号的传导最终都集中到线粒体上来启动或抑制这些事件及其效应的产生。研究发现，凋亡早期线粒体结构保持完整，而坏死细胞的线粒体则发生肿胀，因此将其作为凋亡与坏死的一个重要区别。线粒体的结构和功能的改变，能加速核凋亡特征的出现，是细胞凋亡进程中关键的一步。越来越多的证据表明，线粒体在细胞凋亡中起最基本的作用。现在人们普遍认为，线粒体是凋亡的执行者。鉴于以上研究，本文目的在于认识白藜芦醇诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的机制，从分子水平上了解线粒体在白藜芦醇诱导细胞凋亡中的作用机制。此外，实验初步分析鉴定了白藜芦醇处理前后HepG2细胞线粒体差异蛋白，探求白藜芦醇影响线粒体的具体分子机制，为白藜芦醇防治肝癌提供更广泛、系统的实验依据。研究方法本研究以人肝癌细胞系HepG2为研究对象，采用MTT和流式细胞技术观察不同浓度的白藜芦醇对HepG2细胞的生长抑制作用及其对细胞生长周期的影响。通过Annexin V-FITC／PI双标记及流式细胞技术检测细胞的凋亡率；电子显微镜观察凋亡细胞的形态变化；用rhodamine123（Rh123）和tetramethylrhodamineethyl ester（TMRE）标记细胞△Ψm，并分别通过流式细胞仪和激光扫描共聚焦显微镜检测白藜芦醇对△Ψm的影响。使用calcein和TMRE荧光双标记技术结合共聚焦显微镜检测了白藜芦醇对完整细胞内线粒体通透转变孔道（mitochondrialpermeability transition pore，MPTP）的影响，并使用流式细胞技术检测了Cyt．c的释放，进一步证实了白藜芦醇诱导HepG2细胞凋亡的线粒体通路。为进一步观察白藜芦醇诱导MPTP开放的机制，采用共聚焦显微镜观察白藜芦醇对细胞内钙离子的影响，并建立了细胞的通透性模型，观察钙离子在白藜芦醇诱导MPTP开放中的作用，分析研究了白藜芦醇诱导MPTP开放、Cyt．c释放和钙诱导线粒体钙释放之间的关系。本实验综合的分析研究了白藜芦醇诱导HepG2细胞凋亡的线粒体通路及其诱导MPTP开放的作用机制。此外，采用双向电泳和质谱技术分析鉴定了白藜芦醇处理前后HepG2细胞线粒体差异蛋白。实验结果一、白藜芦醇对HepG2细胞的生长抑制和诱导凋亡作用1．白藜芦醇对HepG2细胞的生长抑制实验结果表明经白藜芦醇处理的HepG2细胞的增殖活性明显弱于未处理组的HepG2细胞（P＜0.01）。说明白藜芦醇能显著性的抑制HepG2细胞的生长增殖，并呈浓度-时间依赖性（F=8.113，P＜0.01）。2．白藜芦醇对HepG2细胞周期的影响流式细胞仪分析显示：白藜芦醇（25、50、100μmol／L）处理细胞后，与对照组相比，S期细胞均明显增多，G2／M期细胞明显减少。说明白藜芦醇能影响HepG2细胞周期，使细胞停滞于S期，抑制细胞DNA的合成。3．白藜芦醇诱导HepG2细胞凋亡的作用白藜芦醇处理HepG2细胞后，透射电镜和荧光显微镜观察结果显示：细胞体积缩小，染色质浓缩，细胞核呈折叠样，部分细胞核裂解为碎块。AnnexinV-FITC／PI双标记结合流式细胞仪分析显示：HepG2细胞经白藜芦醇处理后，凋亡细胞和坏死细胞的总和明显多于对照组凋亡细胞和坏死细胞的总和。实验结果表明白藜芦醇可以诱导HepG2细胞凋亡，并随浓度的增大而增多。二、白藜芦醇对△Ψm、MPTP、Cyt．c和[ca²⁺]_c的影响1．白藜芦醇诱导△Ψm去极化HepG2细胞经25、50、100、150、200μmol／L的白藜芦醇作用后，观察到△Ψm降低，分别为：16.2％，19.5％，25.5％，29.8％，34.2％，提示发生△Ψm去极化，暗示白藜芦醇可能通过降低△Ψm而引起细胞功能障碍。2．白藜芦醇诱导MPTP的开放100μmol／L白藜芦醇作用10h后，大约1／3的线粒体TMRE的荧光强度减弱，同时，线粒体内充满了绿色的calcein荧光，红色TMRE与绿色calcein重合，说明△Ψm去极化，线粒体内膜通透性增加，相应的表明MPTP开放。100μmol／L白藜芦醇作用12h后，基本上所有细胞的△Ψm去极化并且内膜通透性增强，MPTP开放。3．白藜芦醇诱导Cyt．c的释放共聚焦显微镜和流式细胞仪观察到白藜芦醇处理细胞12h后有Cyt．c的释放，结果说明白藜芦醇可使△Ψm降低，诱导MPTP开放，继而促进Cyt．c的释放，从而诱发HepG2细胞凋亡。CsA可以抑制白藜芦醇诱导的△Ψm降低、Cyt．c释放和细胞凋亡，说明白藜芦醇的作用靶点是诱导CsA依赖性的MPTP开放。4．白藜芦醇促进[Ca²⁺]_c的升高100μmol／L白藜芦醇可以引起胞质内Ca²⁺的持续升高。此外，BAPTA／AM可以抑制白藜芦醇诱导的△Ψm去极化和细胞凋亡，而EDTA对此作用很弱。结果暗示△Ψm的去极化可能是由于[ca²⁺]_c的升高所引起的，而[Ca²⁺]_c的升高主要是由于细胞内钙库（内质网和／或线粒体）的动员与再分布有关，Ca²⁺可能是白藜芦醇诱导△Ψm降低和MPTP开放所必需的。三、白藜芦醇促进Ca²⁺介导的MPTP开放1．白藜芦醇促进Ca²⁺介导的MPTP开放白藜芦醇和Ca²⁺处理通透性的细胞后，引起[Ca²⁺]_c的瞬间升高和[Ca²⁺]_c的振荡，△Ψm的降低（代表MPTP的开放）。当100μmol／L白藜芦醇处理细胞后，并没有发生△Ψm的去极化。预先加入0.5mmol／L EGTA鳌合细胞内Ca²⁺，然后100μmol／L白藜芦醇加10μmol／L ca²⁺处理细胞，也没有发生△Ψm的去极化。然而，预先加入0.5mmol／L EGTA之后再加入1.0mmol／LCa²⁺，白藜芦醇却可以诱导△Ψm的去极化。进一步的实验证实，100μmol／L白藜芦醇加1μmol／LCa²⁺不能引起△Ψm的变化，而10～20μmol／L Ca²⁺加100μmol／L白藜芦醇可以使△Ψm降低。2．白藜芦醇促进钙诱导线粒体钙释放而介导的MPTP开放100μmol／L白藜芦醇和10μmol／L Ca²⁺处理，通透性细胞测试体系内线粒体Ca²⁺先快速升高，然后逐渐降低到起始基值水平以下，表明白藜芦醇介导MPTP开放过程中发生钙诱导线粒体钙释放。进一步实验结果显示，100μmol／L自藜芦醇和1μmol／L Ca²⁺不能引起通透性细胞内线粒体Ca²⁺和△Ψm的变化。10μmol／L或20μmol／L Ca²⁺和100μmol／L白藜芦醇，可以引起通透性细胞内线粒体Ca²⁺的升降，也能诱导△Ψm的下降。为了证实这一结果，实验研究了钙诱导线粒体钙释放和白藜芦醇介导MPTP开放之间的关系。Ca²⁺和白藜芦醇刺激之前4min加入1μmol／L RR，——线粒体钙单输送体转运抑制剂，线粒体Ca²⁺的升降变化分别被抑制或被减弱，相应地△Ψm变化被完全或部分抑制。此外，在Ca²⁺和白藜芦醇刺激之前4min加入1μmol／Ltrifluoperazine，——线粒体线Ca²⁺／Na⁺交换抑制剂，线粒体Ca²⁺和△Ψm的变化不明显，即钙诱导线粒体钙释放和MPTP开放未被改变。此外，完整的HepG2细胞体系下也观察到RR可以抑制白藜芦醇诱导的△Ψm降低，Cyt．c释放和细胞凋亡。3．白藜芦醇以浓度-时间依赖方式诱导MPTP开放在加入10μmol／L Ca²⁺之前4min，分别加入100，120，and 150μmol／L的白藜芦醇。另一方面，在加入10μmol／L Ca²⁺之前的0，4，8，12min加入白藜芦醇，结果显示加入白藜芦醇的浓度越高，时间越长，△Ψm降低程度越大。说明在有Ca²⁺的情况下，白藜芦醇可以以时间-浓度依赖方式促进MPTP开放。四、蛋白质组学分析线粒体差异表达蛋白1．线粒体蛋白的分离提取通过对匀浆器的选择、缓冲液的成分，差速离心方法和许可混杂其他细胞器的程度等方面的反复验证，摸索并建立提取细胞线粒体较好的方法。2．双向凝胶电泳和质谱技术鉴定线粒体差异蛋白使用考马斯亮兰染色的制备型双向电泳和质谱方法，分析了白藜芦醇处理HepG2细胞前后线粒体蛋白表达谱的变化。结果处理组和对照组线粒体中大约有860±60个蛋白点可被检测。实验初步分析鉴定了四个显著性差异蛋白，其中，白藜芦醇处理组，有三个蛋白点表达降低，一个蛋白点升高。进行质谱鉴定，4个蛋白质点分别为：A1（Kinesin protein）、A2（Mitochondrial ribosomal proteinL7／L12）、A3（CENP-E）、A4（Peptidase（mitochondrial processing）beta）。结论1．白藜芦醇以浓度-时间依赖性方式抑制HepG2细胞的生长增殖，并能诱导HepG2细胞在S期停滞，抑制细胞DNA的合成。此外，它还可以诱导HepG2细胞凋亡，并随浓度的增大而增多。2．白藜芦醇通过降低△Ψm，促进CsA依赖性MPTP开放和Cyt．c释放而诱导细胞凋亡。此外白藜芦醇可以引起胞质内Ca²⁺的持续升高。而[Ca²⁺]_c的升高主要是由于细胞内钙库（内质网和／或线粒体）的动员与再分布有关。3．Ca²⁺和钙诱导的线粒体钙释放是白藜芦醇诱导△Ψm降低，MPTP开放所必需的。白藜芦醇促进Ca²⁺和钙诱导的线粒体钙释放介导的MPTP的开放，并且以时间-浓度依赖方式诱导MPTP开放。4．实验初步分析鉴定了四个显著性差异蛋白，其中白藜芦醇处理组，有三个蛋白点表达降低：A1（Kinesin protein）、A3（CENP-E）、A4（Peptidase（mitochondrial processing）beta）；一个蛋白点升高：A2（Mitochondrialribosomal protein L7／L12）。