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我国目前流感病毒疫苗都是利用鸡胚基质生产的。然而,由于鸡胚数量的限制和鸡胚工艺扩大生产的可及性差,一旦大流感来临时,用鸡胚基质生产的流感疫苗将远远不能够满足人们需求。而以细胞基质生产流感疫苗则不受鸡胚数量的限制、质量可控、易于扩大规模,且能适用于对鸡蛋蛋白过敏的人群。MDCK细胞是当前最受关注的流感疫苗生产的细胞基质之一。细胞基质病毒性疫苗的培养常常可分为两个阶段,即细胞生长期和产毒期。为了更加高效和经济的研发可靠的疫苗生产工艺,首先设计在实验室规模利用摇床和摇瓶摸索了基本工艺并优化工艺参数。确定细胞传代的参数,按梯度密度（2×106、1.5×106、1×106、7×105和5×105cells/mL）接种细胞于细胞摇瓶,然后对比不同细胞接种密度的细胞生长曲线,同时,监测各实验组间的细胞活率、细胞代谢和细胞周期情况,结果表明在48h时,各梯度密度接种都处于细胞生长分裂的对数生长期,细胞增长最高达到了8.3×106 cells/mL;各梯度密度的细胞接种几乎都在60h生长达到平台期,多数达到了千万cells/mL的细胞密度,且各组细胞活率和代谢差异不明显。为了保证传代时细胞处于对数生长期,传代时间应为48h。在48h对这5个密度梯度取样测G1期细胞比率,发现1.5×106和7×105 cells/mL的接种G1期细胞所占比例最高,细胞生长曲线上1.5×106 cells/mL接种达到的细胞密度最高,为8.3×106 cells/mL,因此确定细胞传代的最佳条件为细胞密度为1.5×106 cells/mL,传代时间为48h。对摇床转速（160、150、140、130、120、110 rpm/min）和细胞生长期的培养温度（38、37、35、33℃）进行了梯度摸索,最终得到最佳条件是转速为130-150 rpm/min和细胞生长温度为37℃。以确定的细胞生长期为基础,进行种毒的条件（MOI、种毒时的细胞密度以及TPCK-胰酶浓度）的摸索。H7N9禽流感病毒的病毒感染复数（MOI）的梯度范围为5×10-2、2.5×10-2、5×10-3、10-3、5×10-4、2.5×10-4、1.25×10-4、2.5×10-5;TPCK-胰蛋白酶的添加梯度范围为2.5、2、1.5、1、0.5和0μg/mL;接种H7N9禽流感病毒时细胞密度的梯度选择为7×106、6×106、5×106、4×106和3×106cells/mL。逐步摸索这几个关键控制点的最优范围或数值,得到H7N9病毒产毒期最佳的参数:种毒细胞密度4×106 cells/mL,H7N9病毒接种的MOI为10-3,TPCK-胰蛋白酶添加量最适范围为1-1.5μg/mL,这些参数可以使H7N9禽流感病毒的血凝滴度达到1:26.5。确定产毒期各基本条件后,进行病毒增值曲线的绘制,发现最佳收毒时间为48h。然而此时的血凝滴度较低,因此适当的优化是极为必要的。在基本工艺参数的基础之上,本研究从营养物或添加物的使用等角度对工艺进行优化。谷氨酰胺是三羧酸循环的关键中间产物之一,适宜的添加谷氨酰胺常常有利于病毒的增殖。以上述研究确定的参数,使用谷氨酰胺添加物GlutaMax按不同的稀释浓度（1、2、4、8 mM）进行添加,未见添加GlutaMax有提升流感病毒血凝滴度的作用,说明所使用的培养基在该参数上已优化到最佳。TPCK-胰蛋白酶在添加后24h内会完全降解,因此研究定时添加TPCK胰酶（每12h添加、仅在12h添加一次和每24h添加三组）以验证其对流感病毒增殖的促进作用,未见补加TPCK-胰酶对产毒的明显影响。使用不同的商业化培养基（培养基A、B、C）配比使用,培养基A:培养基B以1:1配比使用,可以使细胞密度在48h提升2×106 cells/mL,病毒滴度不低于单独使用培养基A。在产毒期换液,每24 h一次,细胞持续生长且表达病毒,提示细胞达到了携病毒生长状态。48h将细胞用Triton-X100将细胞裂解后,培养液中病毒血凝滴度剧增,达到1:29HA units/50μL。以实验室的规模的工艺参数为基础,在7.5L生物反应器进行悬浮放大培养,对搅拌速度、pH、温度和溶氧进行摸索,确定最佳细胞生长期条件。得到细胞生长期最佳pH条件为7.0,溶氧为50%,温度为37℃,搅拌速度为70110 rpm/min。通过本文的研究,开发了基于悬浮MDCK细胞的A/H7N9禽流感病毒疫苗的高效生产工艺,为A/H7N9禽流感病毒疫苗的工业化生产奠定了基础。