研究背景目前以干细胞为基础的细胞疗法正成为再生医学研究领域中的热点和前沿。因间充质干细胞(Mesenchymal stem Cells, MSCs)具有多向分化潜能、超强的扩增能力且不涉及伦理道德问题的困扰而备受重视,逐渐成为替代治疗和基因治疗领域中极具实用价值的细胞来源。对于MSCs研究较多的是来源于骨髓基质干细胞(Bone marrow stem cells, BMSCs)和脂肪组织来源干细胞(Adipose-derived stem cells, ADSCs)。脂肪来源干细胞属于间充质干细胞,在生长动力学、细胞衰老、基因转染效率方面,类似于骨髓干细胞。相对于骨髓来说,脂肪组织可以在美容手术中采用手术风险最小的抽脂术常规获取,因此ADSCs就成为干细胞治疗研究中储量丰富且易于获取的干细胞来源。尽管对动物和人类的研究均显示,ADSCs能够促进组织修复和再生,但到目前为止尚缺乏有效的方法来监测移植细胞在体内的存活、迁移和分化等情况,尤其是移植细胞在组织损伤区的迁移和转归仍缺乏有效的识别和追踪监测手段,因此如何更有效的示踪分析移植的MSCs是研究的热点和难点。常用的干细胞标记方法有化学荧光染料法、磁性标记、基因转染荧光蛋白标记、放射性同位素标记等。荧光染料标记法直观简单,检测时需要处死动物制备组织切片以便于组织学分析鉴定和荧光镜检,不适合活体示踪且荧光染料随着细胞代谢减弱或者转移到未标记细胞上。磁共振成像技术是一种有效的非侵袭性活体示踪移植细胞的方法,磁共振成像技术常用于追踪标记了超顺磁氧化铁纳米微粒的移植细胞,具有对注射细胞进行无创示踪、实时成像的特点。但是,磁共振成像技术不能显示移植细胞的生物学特性,也不能区分细胞在体内的再生和分化是来自于内源性还是外源性。放射性同位素标记的优点是背景信号低,信噪比高,但示踪时间极短,空间分辨力差。绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)是一种新型报告基因,将GFP基因通过载体(如腺病毒、慢病毒、质粒)转染,使活细胞表达GFP蛋白而发出荧光信号,通过光学图像、荧光显微镜或者流式细胞仪检测,但是这种标记物通常用于将动物处死后制作成切片的病理性示踪。合适的外源性细胞标记物应该具有细胞无毒性、生物相容性、标记效率高和检测高敏感性的特点。以上标记方法各有利弊,因此,为了揭示移植细胞在体内的命运,实现同时在活体和离体情况下监测ADSCs,发展多模式追踪技术是必要的。Molday ION Rhodamine-BTM (MIRB)是一种新的超顺磁氧化铁造影剂,具有磁性和荧光的双功能纳米颗粒。用携带增强型绿色荧光蛋白基因(Gnhancement type green fluorescent protein, EGFP)慢病毒转染的方法可将外源基因有效整合到靶细胞的染色体中,使EGFP不受细胞增殖代谢的影响却能持久表达,适用于移植细胞体内功能的研究。荧光标记和磁标记的共标记技术即可以通过组织学分析进行鉴定,同时又有助于实时、动态示踪移植后干细胞在活体内的分布及存活状况。因此将MIRB和EGFP共同标记到AADSCs上可能是一种更有效的标记方法,便于体内多模式追踪移植的ADSCs,但是二者对ADSCs的生物学特性影响以及进行多模式示踪的可行性还需要分析研究。本研究中,我们假设用EGFP和SPIO共标记细胞的方法能够起到互相弥补的作用,然而这种方法对于细胞的生物学性能是否会造成不利的影响还不清楚。因此我们决定对此进行研究并进一步证实。标记细胞的精确定位还应该考虑到这样的事实,即标记细胞的死亡不会导致标记物的消失。从死亡的移植细胞中释放出来的SPIO可能导致对磁共振影像的误解,诸多研究也证实由MRI检测到的SPIO的磁标记信号随着移植时间的延长逐渐减弱,而减弱的SPIO信号是否来源于原来的标记细胞尚不能确定。如何去辨别存活的干细胞以及长期的对干细胞进行示踪仍然有很大的障碍,这也是我们着手想要去解决的问题。目的本研究将建立Lentivirus-EGFP、MIRB共标记的ADSCs并对这种标记方法的可行性进行分析探讨。通过检测两种标记物对ADSCs的有效性和安全性,同时体外对比两种标记物对于ADSCs的跟踪观察时限,从而为利用ADSCs进行活体移植研究提供实验基础。为了探讨Lentivirus-EGFP、MIRB同时进入ADSCs内会否对干细胞的生物学特征产生负面影响,体外观察这两种标记物对ADSCs的细胞毒性、增殖能力、活力以及多向分化潜能等生物学特性的影响。方法1.采用密度梯度离心+贴壁法获取雄性大鼠ADSCs,经体外传代、培养并观察细胞形态学变化,通过流式细胞仪检测ADSCs细胞表型(CD34、CD44、CD45和CD105)及体外成骨、成脂诱导分化对干细胞进行鉴定。2.慢病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白(lentivirus-EGFP)以不同的感染复数(MOI=0,50,100,200,400)转染第3代的ADSCs,于转染后48、72、5d、7d,运用倒置荧光显微镜观察和流式细胞技术检测不同感染复数(MOI)下增强型绿色荧光蛋白的表达并计算细胞转染率,测定最佳转染剂量,即最适感染复数；通过荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察经lentivirus-EGFP标记ADSCs的形态及超微结构变化；用台盼蓝染色镜检计数法检测lentivirus-EGFP标记ADSCs的活性率。3.将含2mg/ml Fe3+的MIRB原液用含10%FBS的DMEM/F12培养基稀释为10μg/ml,用此液对第3代的ADSCs进行等量换液,常规孵育24 h,清洗、离心后继续培养观察。收集MIRB标记的ADSCs进行普鲁士蓝染色后倒置显微镜观察以确定磁标记率,用台盼蓝染色镜检计数法检测MIRB标记ADSCs的活性率。4.取第3代ADSCs细胞制备成细胞悬液,以MOI=400加入携带EGFP的慢病毒载体质粒,24小时后换液,待lentivirus-EGFP标记的ADSCs生长到基本融合时,换用含10μg/ml的MIRB标记液,常规孵育24小时,换液后继续培养3天后收集细胞。通过荧光显微镜观察lentivirus-EGFP和MIRB共标记ADSCs的荧光表达情况。5.评价标记物对ADSCs生物学特性的影响：流式细胞术分析MIRB标记物对GFP转染效率的影响,MTT、台盼蓝染色分别检测比较未标记、lentivirus-EGFP和MIRB单标记及共标记ADSCs的细胞增殖能力、细胞活性率,流式细胞术分析标记细胞的凋亡率,JEM1400透射电子显微镜检测细胞内铁颗粒分布情况,成脂诱导分别检测MIRB-ADSCs和EGFP-MIRB-ADSCs的细胞定向诱导分化能力。6.通过低渗溶解法制备SPIO+的标记细胞碎片,将等量碎片分别与未标记和lentivirus-EGFP标记的ADSCs在体外共培养7天,用荧光显微镜和共聚焦显微镜进行观察分析,进一步再用普鲁士蓝染色确定铁颗粒的分布。结果1. ADSCs贴壁生长,呈成纤维细胞样形态；第3代ADSCs经流式细胞仪分析得出细胞表面高表达CD44、CD105,不表达CD34、CD45;2.携带EGFP基因的慢病毒感染第3代ADSCs,48小时后可见绿色荧光的表达,绿色荧光5d达到表达顶峰,以后持续稳定表达,流式细胞术分析慢病毒感染效率达81.4%。3.第3代ADSCs与10μg/ml的MIRB标记液共同孵育24小时,荧光显微镜下可观察到由罗丹明-B发出的红色荧光,普鲁士蓝染色后光镜检查细胞内有蓝色颗粒,二者的标记率基本一致,并接近100%。电镜及普鲁士蓝染色可见胞浆内大量铁颗粒,呈囊泡状分布于细胞质中。4. EGFP标记的ADSCs细胞经MIRB标记3天后,经流式细胞术分析,MOI为400的感染组的标记效率为82.3%,与之前的未标记细胞的感染效率相比,说明MIRB标记对EGFP转染效率虽然不相同,但是相差很小。MTT检测台盼蓝实验和细胞凋亡流式分析检测均显示共标记法不影响细胞的活性(t=-1.509,p=0.738,p>0.05)、增殖能力(主效应：f=0.187,p=0.905 p>0.05,交互效应：f=0.527,p=0.851p>0.05)、细胞凋亡坏死；成骨和成脂诱导分化实验中,共标记细胞同未标记细胞一样具有潜在的成骨、成脂分化潜能,说明使用我们这种共标记方法对细胞是无毒性的,可应用于将来的细胞治疗研究中。5.荧光显微镜下观察可发现,共标记ADSCs内由MIRB和EGFP发出的荧光强度随培养时间可发生变化,EGFP发出的绿色荧光可维持稳定持久的表达,在第1至4周间的荧光强度和密度均无明显变化,MIRB中由罗丹明-B发出的红色荧光发生进行性的荧光强度和密度的减弱,细胞培养至第4周时,MIRB标记的荧光强度则开始出现较明显的减弱。6.使用SPIO+标记细胞碎片与未标记或EGFP标记细胞共培养培养1w,再用共聚焦显微镜观察EGFP标记细胞组能同时发出红色和绿色的荧光；未标记ADSCs组也能发出明显的红色荧光。然而,与未标记细胞碎片共培养的未标记或EGFP标记细胞均未发出红色荧光。7.统计学方法所有数据用均数±标准差(x±s)表示,用SPSS13.0.进行分析。组间比较,方差齐者,用单因素方差分析(One-way ANOVA);多重比较用LSD法进行两两比较,方差不齐时用Dunnett T3法。P<0.05时认为差异具有统计学意义。结论1.经lentivirus-EGFP转染的ADSCs标记效率高,可随着细胞传代培养持续稳定持久地表达EGFP, lentivirus-EGFP对ADSCs的生物学特性无明显影响。2. MIRB标记ADSCs简单、快捷且几近完全,标记后细胞内证实具有铁颗粒阳性以及镜下红色荧光的双重表达。MIRB是SPIO和Rhodamine B偶联的一种新型标记物,通过细胞摄取的方式标记到细胞上。3. lentivirus-EGFP和MIRB共标记的ADSCs能够持久、稳定的表达由GFP发出的绿色荧光,而由MIRB发出的红色荧光会发生进行性衰减,二者在长期干细胞移植研究的不同阶段中可以相互印证和弥补。4. lentivirus-EGFP和MIRB共标记ADSCs是可行的,两种标记物对细胞的生物学特性无毒副作用,是安全的。5.经过共标记的ADSCs可以被用来有效的实施由MRI进行的非侵入性、实时的非病理性示踪,以及在荧光显微镜下对移植细胞进行精确定位分析的病理性示踪,这种多模式成像示踪有望得到更加确实可靠、经济实在的研究数据。6.由于SPIO标记细胞的死亡破裂形成的细胞碎片可被未标记的同种类细胞摄取,最终可能导致所检测到的SPIO阳性细胞不是原来的标记细胞。SPIO标记细胞在移植细胞学研究中可用于短期、非侵入性的示踪,但是这种方法会随着时间增加假阳性的风险,单独使用SPIO可能不适用于长期作为细胞的示踪剂。SPIO标记的干细胞在体内的存活单靠MRI是不能检测准确的,使用SPIO和GFP共标记细胞对辨别体内移植后存活的SPIO标记细胞来源也提供了一个可行的方法。