论文部分内容阅读
CGI-58(comparative gene identification-58)是脂肪甘油三酯脂肪酶(Adipose triglyceride lipase,ATGL)的促进因子,在机体甘油三酯代谢中发挥重要作用。本研究以秦川牛肉用新品系(以下简称“秦川肉牛”)为研究对象,采集其血液、组织及细胞样品,分别从分子水平、细胞水平以及DNA与蛋白互作水平探究CGI-58基因的转录调控机制及其与牛肉品质的关联。本研究在转录水平研究CGI-58基因在脂质代谢中的作用,探究其与肉质性状的关系,对于畜禽肉品质的改良具有一定的指导意义。本研究有如下结果:1、以秦川肉牛不同生长阶段各组织cDNA为模板,使用qRT-PCR的方法构建了CGI-58基因在秦川肉牛新生牛和成年牛的组织表达谱。本试验在秦川肉牛阉牛6月龄和18月龄的肌肉和脂肪组织中检测了CGI-58和ATGL的表达情况,发现伴随着年龄的变化,CGI-58和ATGL基因表达表现出近似的变化趋势。2、分离鉴定了秦川肉牛前体脂肪细胞,并在秦川肉牛前体脂肪细胞成脂分化过程中检测了CGI-58和ATGL基因的相对表达量,发现在诱导的第0~10 d均有表达。3、以秦川肉牛脂肪组织cDNA为模板,利用5’cDNA末端快速克隆(5’rapid-amplification of cDNA ends,5’RACE)确定了CGI-58基因转录起始位点,并通过PCR扩增得到CGI-58基因5’调控区2 033 bp的片段。使用生物信息学软件预测到扩增的片段中存在一个CpG岛及11个重要的转录因子。通过构建6个逐段缺失片段重组质粒转染秦川肉牛前体脂肪细胞并检测其活性,确定CGI-58关键转录调控区,并初步判断其中可能结合的转录因子的作用。4、通过定点突变的方法证明CGI-58基因5’-调控区ZEB1转录因子结合位点的突变可以显著提高CGI-58基因在秦川肉牛前脂肪细胞的启动子活性(P<0.05),通过凝胶电泳迁移实验证明ZEB1转录因子可以和CGI-58基因DNA序列发生特异性结合。5、通过直接测序的方法检测到秦川肉牛CGI-58基因5’-调控区中一个新型单核苷酸多态位点SNP g.14451079A>C,分析发现其与肉品质以及CGI-58基因的启动子活性具有显著的关联(P<0.01)。本研究表明,成脂调控网络中的重要转录因子ZEB1对秦川肉牛CGI-58基因的启动子活性具有抑制作用,且CGI-58基因启动子区g.14451079A>C位点的单核苷酸多态性与肉品质之间存在关联,同时对该基因启动子活性有极显著影响。