研究背景类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是一种以慢性侵蚀性周围关节炎为主要表现的自身免疫性疾病。发病率约为0.3～1%,其致残率高,对病人的心理状况和生命质量带来极大的负面影响。RA的病因及发病机制尚不完全清楚,迄今尚无根治疗法。因此对RA进行深入研究具现实意义。T细胞介导的自身免疫反应一直被认为在RA的发病机制中起重要作用,已经明确CD4+T细胞参与了RA的发病机制。既往认为RA是Thl占优势的自身免疫病。RA患者滑膜中存在大量IFN-γ+Th1细胞的克隆,但是Th2型细胞因子IL-4含量很低或检测不出,并发现大量IFN-γ+Th1细胞趋化到滑膜和滑液局部,滑液中CD4+IFN-γ+T细胞的百分率也高于外周血中,滑液中Th1/Th2比值也与患者活动性高度相关。但越来越多的研究结果提示Thl细胞可能在RA发病中并非占有主导地位：IFN-γ基因敲除鼠仍可发生自身免疫病,甚至对自身免疫病更易感；阻断IFN-γ的治疗并不能使胶原诱导性关节炎（collagen induced arthritis, CIA）小鼠病情缓解,使曾经被认为在RA起重要作用的Thl型细胞因子IFN-γ作用受到质疑。这说明除Thl外,还存在其他能诱导自身免疫的细胞亚群。调节性T细胞（Regulatory T cells, Tregs）和辅助性T细胞17（T help cell17,Th17）的发现,弥补了Th1/Th2介导效应机制的不足,并成为免疫学及相关领域的研究热点。Treg的最显著功能特征是无反应性和免疫抑制,它可以通过直接接触抑制和分泌抗炎细胞因子,如IL-10和转化生长因子β（TGF-β）,限制抗感染效应细胞的过度反应,保护周围正常组织免受损伤,在维护机体免疫平衡中发挥了重要作用。Foxp3（foxhead box protein3,叉头样转录因子P3）是Treg细胞最特异的标记物,控制Treg细胞的发生发育,逆转录Foxp3可以转化初始型CD4+CD25-T细胞,使其成为具有调节活性的Treg细胞；相反剔除Foxp3基因的小鼠,可导致小鼠产生致死炎症疾病。研究显示缺乏Treg细胞的小鼠早期即可出现严重的侵蚀性关节炎；早期RA患者的外周血中的CD4+CD25+Treg的数量比健康对照低。可能正是因为这种细胞数量上的缺失,导致了免疫抑制功能的低下,给疾病的发生发展创造了条件。Th17细胞被认为是一群重要的介导炎症反应的细胞,分泌高水平的IL-17具有强大促炎效应,能够通过多种途径参与RA关节的慢性炎症和进行性损害。RORγt （retinoid related orphan receptor γt,转录因子维甲酸受体相关孤儿受体γt）是Th17细胞特异性的转录调控因子,研究证实,无论体外细胞因子诱导的Th17细胞的分化,还是体内Th17细胞介导的炎症反应都需要RORγt的参与,是促进Th17细胞分化的关键转录调节因子。在CIA鼠模型中局部过表达IL-17能够显著上调RANKL及其受体的表达,因此能够破坏滑液中RANKL/OPG的平衡而加重骨破坏。动物实验初步结果显示,在关节炎早期阶段应用中和性抗IL-17抗体可以显著减轻关节炎的严重程度。另有研究采用抗IL-17的抗体或疫苗进行阻断治疗,也达到缓解关节炎症状,减少关节损伤的疗效。Treg细胞与Th17细胞之间存在复杂关系,二者在功能上相互拮抗,而在分化上相互抑制。TGF-β在机体Treg （?）口Th17细胞分化平衡中起重要的调控作用。TGF-β通过诱导Foxp3的表达来促进Treg的产生,从而抑制炎症,防止自身免疫反应；在感染环境下,内源性TGF-β与炎症介质IL-6或IL-21通过抑制Foxp3的表达,使RORγt介导的Th17细胞分化途径启动,而后随着炎症介质如IL-6水平的降低,Foxp3的表达在抑制RORγt的功能同时促进Treg的分化,维持Treg的功能,在清除感染后将效应细胞的功能控制在合适状态。TGF-β主要信号途径相对简单。Smads蛋白家族在TGF-p信号转导途径中扮演着重要角色,Smad2/3是TGF-β信号下传的第一个信号分子,属受体激活型Smad （R-Smads）,在胞浆中与共同受体Smad （Co-Smad）协同参与信号转导。Smad7则抑制Smads复合物的形成或抑制Smad2、Smad3磷酸化而阻止该信号的转导过程。Smads蛋白对于TGF-β信号的动态调控具重要意义。激活的Smad蛋白复合物转位进入细胞核,并与其他核辅助因子共同调节靶基因的转录。TGF-β/Smad通路能否作为疾病治疗及发展药物作用的靶点等问题仍需进一步探讨。由于RA发病机制尚不明确,至今RA仍无根治的方法。相当一部分RA患者采用常规的治疗难以控制症状,而且缺乏证据证实这些治疗可以抑制关节病变的进展和改善疾病的预后。在过去的10年中,生物制剂已成为RA治疗的主要突破点。TNF-α在RA患者外周血以及滑膜局部的高表达,体外实验显示中和TNF-α后减少其他炎性因子的分泌,因此拮抗TNF-α作为RA的治疗靶点。近年将TNF-α拮抗剂用于治疗活动性RA获得成功,临床试验表明抗TNF-α治疗不但能够改善RA患者的症状和提高功能,而且可以有效控制病情的进展,这是RA临床治疗的一个飞跃。尽管不同的临床随机试验已证实了各种’TNF-α拮抗剂的有效性,但对其在RA治疗中的机制还需要进一步的研究和探讨。有体外研究认为肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白（TNFR-Fc）对关节炎的治疗作用与诱导Treg细胞无关。但与此相矛盾的研究报道比比皆是,之前已有研究报道抗TNF-α治疗不但使RA体内Treg细胞免疫抑制功能恢复,还使其数量增加；对Crohn’s病的研究结果显示抗TNF-α抗体不仅能直接中和TNF-α,还可能影响粘膜调节性T细胞的活化和扩增,从而恢复粘膜内环境的稳态。而对Thl7细胞的影响,有研究推测TNF-α拮抗剂可能通过阻断TNF-α使前炎性因子释放减少或反向信号抑制细胞增殖或通过caspase3途经促进T细胞的凋亡,从而下调分泌IL-17的Thl7细胞合成,但二者在体内相互作用的具体途径有待于进一步探索。而TNF-α拮抗剂对Treg/Th17细胞平衡的影响是否涉及TGF-β/Smad通路,未见报道。在正常情况下Treg细胞和Th17细胞的效应处于一种平衡状态,Treg/Th17平衡失调在组织炎症和自身免疫性疾病等疾病的发生发展中具有重要作用。然而,Treg/Th17失衡在RA和关节滑膜病变形成中的作用,以及Treg和Thl7细胞分化所涉及TGF-β/Smad信号通路以及能否作为疾病治疗及发展药物作用的靶点等问题尚有待于进一步探讨。为明确以上问题,本研究建立大鼠CIA模型,观察TNF-a拮抗剂治疗对关节滑膜病变和Treg/Th17平衡的影响；以临床病人为研究对象,检测RA患者Treg和Th17关键转录因子及相关细胞因子表达情况,探讨外周Treg/Th17失衡与RA病情活动度的关系；通过TNF-α拮抗剂TNFR-Fc治疗观察对Treg/Th17平衡的影响,并首次从其对Treg （?）口Th17细胞分化及TGF-β/Smad通路的影响来探讨其机制；从而进一步明确RA的免疫学发病机制及探索在此环节上进行干预治疗的意义,为临床RA的干预治疗提供新思路。目的1、观察TNF-α拮抗剂治疗对大鼠CIA模型关节滑膜中Treg/Th17平衡及相关细胞因子的影响。2、探讨Treg与Thl7细胞和相关细胞因子在RA中的失衡表达及与RA疾病活动度的关联。3、探讨TNF-α拮抗剂TNFR-Fc治疗对Treg/Th17分化及TGF-β/Smad通路的影响。方法1、胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠关节滑膜组织Treg/Th17平衡及TNF-a拮抗剂对其影响研究30只Lewis大鼠随机分成正常对照组、模型组、治疗组。将牛源性Ⅱ型胶原和等体积不完全弗氏佐剂混合、乳化后,模型组和治疗组大鼠于尾根部及背部多点皮下注射0.4m1/只,正常对照组大鼠皮下注射等量生理盐水。7天后加强免疫,第13天治疗组开始采用10mg/kg TNFR-Fc厦腔注射,隔日一次；模型组则予等量生理盐水腹腔注射,隔日一次。每周1次进行关节炎的分级评估,建模后35天处死大鼠,ELISA检测血浆TNF-α,关节滑膜进行甲苯胺蓝、HE染色,光学显微镜下观察各组大鼠病理组织学变化,免疫荧光双标记法检测各组大鼠关节滑膜CD4+T细胞Treg/Th17关键转录因子Foxp3/ROR γ t的表达,免疫组织化学法检测各组大鼠关节滑膜组织TGF-β1、IL-10、IL-17蛋白的表达。2、RA患者外周血Treg/Th17的失衡表达及其临床意义40例活动期RA病人（35例女性和5例男性）为2010年9月—2011年1月在广州医学院第二附属医院门诊及住院病人,所有病人均符合1987年美国风湿病学会（ACR）的RA分类标准。活动期必须同时满足下列条件：（1）4个或以上的关节肿胀；（2）6个或以上的关节触痛；（3）符合下面两条标准中任意1条：随访当日晨僵持续时间≥45min,血沉（魏氏法）≥28mm/h,C反应蛋白（CRP）>10mg/L。临床评估包括压痛和肿胀关节数,疼痛视觉模拟评分（VAS评分）,健康评估问卷（HAQ）、DAS28评分和实验室指标红细胞沉降率（ESR）、C反应蛋白（CRP）、类风湿因子（RF）。健康对照组：健康体检者40例,其中女性35例,男性5例,平均47.2岁（20—70岁）。年龄和性别比均衡性检验显示RA组和健康对照组间无差异。获得研究对象知情同意后,抽取外周静脉血。ELISA检测RA患者和健康对照Treg/Th17相关细胞因子（包括TGF-β1、IL-10、IL-17）表达水平。realtime-PCR检测Treg/Th17关键转录因子Foxp3/ROR γt mRNA表达水平。3、TNF-α拮抗剂对RA外周血Treg/Th17失衡的影响及其机制40例活动期RA病人纳入标准及临床评估同第一部分。研究者对受试者进行研究前,已经对受试者进行知情同意,并得到受试者的书面知情同意书。经筛选检查证实符合加入试验的条件后,受试者按2：1的比例被随机分配到治疗组或对照组,治疗组为rhTNFR:Fc+MTX,对照组为安慰剂+MTX。受试者接受皮下注射rhTNFR:Fc或同等体积的安慰剂,25mg/次,2次/周,并在试验第0、6、12周按规定完成临床病情的评估及相应的实验室检查等,由同一个医师对病人进行定期随访。研究结束时DAS28评分改善≥1.2或DAS28≤3.2定义为治疗有效。治疗组（28例）和对照组（12例）,年龄和性别比均衡性检验显示两组间无差异（年龄：t=1.322,P=0.194；性别：χ2=2.449,P=0.118）；两组患者在基线时疾病状况差异无统计学意义,具可比性（关节压痛数、关节肿胀数、VAS评分、HAQ评分、ESR、CRP、RF、DAS28评分,P均>0.05）。ELISA检测RA患者治疗前后Treg/Th17相关细胞因子（包括TGF-β1、IL-10、IL-17）表达水平。realtime-PCR检测RA患者治疗前后Treg/Th17关键转录因子Foxp3/ROR γ t和相关细胞因子（包括TGF-β1、IL-10、IL-17）以及TGF-β/Smad通路（包括Sirad2、Smad3、Smad7） mRNA表达水平。4、统计学处理数据用均数±标准差（x±s）表示,计量资料组间比较,先进行方差齐性检验,方差齐时进行独立样本t检验或方差分析,方差不齐时采用非参数Mann-WhitneyU检验和Kruskal-Wallis检验；组间多重比较采用SNK法或Dunn’s多重比较；治疗前后比较根据数据分布类型采用配对T检验或符号秩和检验；不同指标间的相关性用Spearman分析。结果一、胶原诱导性关节炎大鼠关节滑膜组织Treg/Th17平衡及TNF-α拮抗剂对其影响1、模型的鉴定及评价造模后模型组大鼠平均第18天出现明显关节炎症状,后足首先出现红肿,然后前足红肿,随时间延长,于21天左右达到高峰,严重者不能负重,关节活动障碍,提示大鼠CIA模型建立。治疗组大鼠出现关节炎时间与模型组大致相似,高峰时间延迟至第28天,且关节炎程度较模型组显著减轻（P<0.001）。对照组关节无异常改变。病理学观察结果显示,正常大鼠滑膜组织细胞排列规则,未见淋巴细胞及浆细胞的浸润及软骨染色缺失；模型组大鼠关节滑膜组织呈重度增生,滑膜层变厚,排列紊乱,大量淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞浸润,软骨重度缺失；治疗组HE染色滑膜增生及炎症细胞浸润较造模组轻,甲苯胺蓝染色软骨染色丢失较单纯造模组为轻。非参数Kruskal-Wallis检验分析ELISA结果,显示三组间TNF-α浓度有统计学差异（χ2=15.158,P=0.001）,进一步采用Dunn’s多重比较显示模型组显著高于正常对照组（713.33±145.83pg/ml vs24.86±3.12pg/ml,P<0.05）,而治疗组与正常对照组间差异无统计学意义（67.62±20.05pg/ml vs24.86±3.12pg/ml,P>0.05）2、关节滑膜Foxp3、ROR-γt表达的比较结果显示Treg和Th17细胞主要分布在滑膜衬里细胞层及血管周围；方差分析结果显示三组间CD4+Foxp3+Treg/CD4+细胞比例存在差异（F=6.096,P=0.012）,CD4+ROR γ t+Th17/CD4+细胞比例也有统计学差异（F=40.791,P<0.001）。模型组的CD4+Foxp3+Treg/CD4+细胞比例与正常对照组无明显差异（23.12±4.939%vs24.66±5.82%,P>0.05）,治疗组（33.07±5.14%）则较正常对照组和模型组增高（P<0.05）；模型组CD4+ROR γ t+Thl7/CD4+细胞比例较正常对照组和治疗组增高（模型组9.74±2.23%vs正常对照组1.00±0.59%,治疗组5.63±1.76%,P<0.05）,而治疗组也较正常对照组高（P<0.05）。3、关节滑膜TGF-β1、IL-10、IL-17表达的比较免疫组织化学分析结果显示,TGF-β1除了分布在滑膜衬里细胞层及血管周围外,还可见于软骨表面；IL-10、IL-17主要位于滑膜衬里细胞层及血管周围。方差分析显示三组间的TGF-β1（F=19.841,P<0.001）、IL-10（F=21.798,P<0.001）、IL-17（F=8.958,P=0.003）表达均存在统计学差异。模型组TGF-β1蛋白的表达显著高于正常组和治疗组（P<0.05）,正常组和治疗组之间无统计学差异（P=0.12）；而IL-10蛋白的表达显著低于正常组和治疗组（P<0.05）,正常组和治疗组之间无统计学差异（P=0.061）；IL-17蛋白的表达显著高于正常组和治疗组（P<0.05）,正常组和治疗组间无差异（P=0.149）。二、RA患者外周血Treg/Th17的失衡表达及其临床意义1、RA与健康对照组之间关键转录因子Foxp3/ROR γt和相关细胞因子（包括TGF-β1、IL-10、IL-17）表达的比较RA组Foxp3mRNA表达较对照组显著减少（0.6542±0.3037vs.1.4811±0.2958,t=-10.099,P=0.000）,ROR γt mRNA表达高于对照组（1.0278±0.3038vs.0.4066±0.1519,U=12.000,P=0.000）；RA组IL-10蛋白水平低于健康对照组（115.16+83.80vs.204.86±66.01,t=-5.238,P<0.001）,而TGF-β1则显著高于健康对照组（45386.31+16955.90vs.6328.75±1670.48,t=40.000,P<0.001）,IL-17蛋白水平也明显高于对照组（88.33±90.12vs.45.56±22.42,U=474.500,P=0.01）。2、RA患者关键转录因子Foxp3/ROR γt的表达与临床活动度及实验室指标的关系RA患者外周血中Foxp3mRNA与关节压痛数、关节肿胀数、患者疼痛模拟视觉评分（VAS）、健康评估问卷（HAQ）、DAS28评分等临床活动指标无明显关系,而与ESR、CRP、RF等实验室指标也无明显相关性。RORγt mRNA与关节肿胀数呈正相关（r=0.495,P<0.05）,与RF滴度正相关（r=0.453,P=0.014）,但与其他临床活动指标及实验室指标也无明显相关性。把RA组分为ESR<28、28<ESR<100和ESR>₁00三组,采用方差分析进行比较,结果显示三组间的Foxp3mRNA表达无统计学差异（F=2.360,P=0.114）,ESR>100的高炎症程度患者的Foxp3mRNA表达水平低于ESR<28的病人但未达统计学意义（0.3623±0.2233vs.0.7707±0.2848,P>0.05）；而三组间的ROR γt mRNA表达具统计学差异（F=6.334,P=0.006）,ESR>100的病人其ROR γt mRNA表达水平高于ESR<28和28<ESR<100的病人（1.5297±0.1652vs.0.9844±0.2446,0.9608±0.2762,P<0.05）。3、细胞因子与Foxp3/ROR γt的表达及临床活动度、实验室指标的关系IL-10与Foxp3mRNA表达正相关（r=0.495,P=0.01）,而与关节压痛数、关节肿胀数、患者疼痛模拟视觉评分（VAS）、健康评估问卷（HAQ）、DAS28评分等临床病情活动指标无明显关系；TGF-β1与Foxp3mRNA、ROR γ t mRNA的表达、临床病情活动指标均无相关性；IL-17与ROR γt mRNA表达正相关（r=0.461,P=0.02）,与关节压痛数、关节肿胀数正相关（关节压痛数r=0.341,P=0.042；关节肿胀数r=0.448,P=0.006）,与其他指标无相关性。三、TNF-a拮抗剂对RA外周血Treg/Th17失衡的影响及其机制1、治疗组与对照组治疗前后临床疗效比较rhTNFR:Fc治疗12周后,关节压痛数（Z=-2.443,P=0.015）、关节肿胀数（Z=-4.492,P<0.001）、疼痛VAS评分（Z=-3.606,P<0.001）和ESR（Z=-4.442,P<0.001）、CRP（Z=-2.722,P=0.006）、DAS28评分（Z=-4.441,P<0.001）等疗效指标均较基线时水平明显降低,而健康状况问卷（HAQ）（Z=-0.904,P=0.366）和RF（Z=-0.148,P=0.882）则与基线水平无明显差异；对照组治疗12周后,关节压痛数（Z=-0.307,P=0.759）、关节肿胀数（t=0.099,P=0.923）、HAQ（Z=-0.866,P=0.387）和ESR（t=1.494,P=0.163）、CRP（Z=-0.356,P=0.722）、RF（Z=-0.784,P=0.433）、DAS28评分（t=1.018,P=0.330）等疗效指标均较基线时水平无明显差异,仅疼痛VAS评分较基线时水平降低（t=2.446,P=0.032）。2、治疗组与对照组治疗前后Foxp3/ROR Y t和相关细胞因子（包括TGF-β1、IL-10、IL-17）表达的比较在12周抗TNF治疗结束后,治疗组Foxp3和IL-10mRNA表达较治疗前升同（Foxp3治疗后1.1244+0.3244vs.治疗前0.7374±0.2777,t=-4.552,P<0.001；IL-10治疗后1.0579±0.2573vs.治疗前0.5261±0.1594,t=-7.508,P<0.001）,RORγt、GF-β1、L-17mRNA表达较治疗前降低（RORγt治疗后0.8230±0.2692vs.治疗前1.0777±0.2830,t=-3.230,P=0.001；TGF-β1治疗后0.6651±0.1902vs.治疗前0.8853±0.1845,Z=-3.806,P<0.001；IL-17治疗后0.8753±0.2093vs.治疗前1.0238+0.1880,t=3.546,P=0.002）。治疗组IL-10蛋白水平较治疗前显著增高（治疗后219.12±±57.15vs.治疗前123.90+87.24,Z=-3.829,P<0.001）,TGF-β1和IL-17蛋白水平较治疗前显著降低（TGF-β1治疗后26607.84±9984.16vs.治疗前45643.54±18999.01,t=4.699,P<0.001；IL-17治疗后57.07±33.04vs.治疗前73.59+46.35,Z=-2.291,P=0.022）。对照组Foxp3mRNA表达较治疗前显著增高（治疗后0.9730±0.4744vs.治疗前0.3925±0.2348,Z=-2.197,P=0.028）,而ROR γt、IL-10、 TGF-β1IL-17mRNA表达治疗前后无明显改变（ROR γ t治疗后0.8592±0.3929vs.治疗前0.8709±0.3355,t=0.093,P=0.929；IL-10治疗后0.5763+0.1587vs.治疗前0.5481±0.1313,t=-0.668,P=0.529；TGF-β1治疗后0.5147±0.2586vs.治疗前0.8300±0.2955,t=1.403,P=0.210；IL-17治疗后1.0469±0.2457vs.治疗前1.0995±0.1460,t=0.660,P=0.534）。对照组TGF-β1蛋白水平较治疗前下降（治疗后25042.03±10949.11vs.治疗前44850.40±12365.26,t=7.538,P<0.001）,IL-10、IL-17蛋白水平治疗前后无明显改变（IL-10治疗后158.48±52.96vs.治疗前96.96±76.44,Z=-1.646,P=0.100）、（IL-17治疗后111.95±104.28vs.治疗前121.83±146.60,Z=-1.027,P=0.284）。3、治疗组中治疗有效和无效者Foxp3/ROR γ t （?）]相关细胞因子（包括TGF-β1、IL-10、IL-17）表达的比较结果显示无论是治疗有效还是无效患者,治疗后Foxp3mRNA表达均较治疗前显著增高（有效患者治疗后1.1109±0.3713vs.治疗前0.6684±0.3404,t=-3.492,P=0.005；无效患者治疗后1.1405±0.2766vs.治疗前0.8203±0.1559,t=-2.850,P=0.019）,而ROR γ t mRNA表达则均较治疗前降低（有效患者治疗后0.8097±0.3425vs.治疗前1.0744±0.3613,Z=-2.118,P=0.034;无效患者治疗后0.8390±0.1588vs.治疗前1.0817±0.1652,t=3.341,P=0.009）。治疗有效患者治疗后TGF-β1的mRNA （0.3438±0.0921vs.0.7094±0.1881,t=5.050,P<0.001）和蛋白水平（27986.77±10627.45vs.49391.23±23002.53,t=3.195,P=0.007）均显著下降,IL-10mRNA （1.0410±0.3065vs0.5182±0.1745,Z=-2.934,P=0.003）和蛋白水平（217.67±52.81vs.138.43±111.29,t＝-3.080,P=0.009）均显著高于治疗前,IL-17mRNA较治疗前降低（0.8033±0.1836vs.1.0160±0.1982,t=4.129,P=0.002）,蛋白水平也较治疗前稍降低,但未达统计学意义（48.87±28.99vs.65.66±34.69,Z=-1.960,P=0.050）；无效者治疗后TGF-β1的mRNA（0.3276±0.0924vs.0.6163±0.1900,t=3.441,P=0.007）和蛋白水平（24852.83±9293.26vs.40873.77±11565.87,t=4.335,P=0.001）均显著下降,IL-10水平（mRNA:1.0765±0.2051vs.0.5348±0.1500,t=-6.680,P<0.001；蛋白：220.97±64.87vs.105.41±8.66,t=-5.899,P<0.001）升高,但IL-17水平与治疗前无明显改变（mRNA:0.9545±0.2158vs.1.0324±0.1864,Z=-1.274,P=0.203；蛋白：67.52±36.26vs.83.67±58.23,Z=-1.246,P=0.213）。进一步分析所有RA病人治疗后DAS28评分与Treg、Th17细胞以及细胞因子的相关性,发现治疗后DAS28评分与基线时的Foxp3mRNA表达负相关（r=-0.380,P=0.042）,与基线时的ROR γ t mRNA表达（r=0.407,P=0.028）、12周的IL-17蛋白水平（r=0.362,P=0.030）呈正相关；除此以外,治疗后DAS28评分与其他细胞因子无相关性。当我们进一步分析不同组中治疗后DAS28评分与Treg、Th17细胞相关性时,仅发现TNF-α拮抗剂治疗组DAS28评分与基线时的ROR γ t mRNA表达存在正相关（r=0.430,P=0.046）。4、治疗组与对照组治疗前后TGF-β/Smad通路（包括Smad2、Smad3、Smad7）mRNA表达的比较抗TNF治疗12周后的RA患者Smad2的表达较基线水平降低（0.3361±0.0903vs.0.2936±0.0976,Z=-2.728,P=0.006）,Smad3较基线水平升高（0.3132±0.1216vs.0.3841±0.1288,t=-4.124,P=0.001）,而Smad7mRNA的表达则稍降低,但无统计学意义（1.1218±0.2157vs.1.0387±0.2268,t=1.566,P=0.133）；予MTX治疗的对照组RA患者Smad2（0.3773±0.0471vs.0.3406±0.0582, t=1.808, P=0.121）、Smad3（0.2149±0.1172vs.0.3201±0.1138,t=-1.643, P=0.151）、Smad7（1.1072±0.1538vs.1.0194±0.1681, t=1.271, P=0.251） mRNA的表达治疗前后无明显差异。5、治疗组中治疗有效和无效者TGF-β/Smad通路（包括Smad2、Smad3、 Smad7） mRNA表达的比较治疗有效的病人（DAS28评分改善≥1.2或DAS28≤3.2）,Smad2的表达较基线水平降低（0.2786±0.0870vs.0.3438±0.0921, t=3.660, P=0.004）, Smad3较基线水平升高（0.4206±0.1204vs.0.3280±0.1270,t=-3.660,P=0.004）,而Smad7则无明显改变（1.008±0.2076vs.1.153±0.2051,t=1.790,P=0.104）：无效的患者Smad2、Smad3、Smad7mRNA表达治疗前后均无明显差异（Smad20.3276±0.0924vs.0.3102±0.1102, t=0.944, P=0.370; Smad30.2968±0.1198vs.0.3440±0.1318, t=-2.154, P=0.060; Smad71.0874±0.2326vs.1.0721±0.2530, t=0.236, P=0.819）。结论1、RA外周及关节滑膜存在Treg/Th17分化及功能失衡,疾病活动度越高的患者Treg/Th17分化失衡越显著,提示Treg/Th17失衡可能在RA的发病中起重要作用；2、RA患者外周血Treg/Th17分化失衡及功能失调在抗TNF治疗（TNFR:Fc）治疗下得以恢复,而且这种恢复并非MTX的作用。3、基线时Th17的ROR γt mRNA表达水平可能是预测TNF-α拮抗剂治疗效果的有用指标,而IL-17的蛋白水平可能更与病情活动度相关。4, TGF-β/Smad通路参与TNF-α拮抗剂对Treg/Th17细胞平衡的调控,可能是通过下调Smad2、上调Smad3的表达,从而促进Treg分化及功能恢复,抑制Th17细胞分化及IL-17表达。