枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的内生孢子,对多种病害病原菌产生抑制作用,是一种理想的生防菌。前期分离筛选到的植物内生枯草芽孢杆菌BSD-2,对蔬菜灰霉病、叶霉病、枯萎病等多种植物病原菌有较强的抑制作用。本文主要从BSD-2抗菌物质的分离、防病效果、诱导黄瓜抗灰霉病机理等方面进行研究。对枯草芽孢杆菌BSD-2代谢所产抑菌物质进行初步分离,得到最佳条件为盐酸调p H至2.5,60%浓度的乙醇对沉淀进行抽提,抽提所得物质采用葡聚糖凝胶G-50进一步分离收集到两个峰的物质,其中第二个峰收集的物质对黄瓜灰霉病菌具有良好抑制作用。风干后沉淀溶于磷酸缓冲液中冷冻干燥得到枯草芽孢杆菌BSD-2代谢产物中的抗菌物质粗提物抗菌素。枯草芽孢杆菌BSD-2及其抗菌物质对黄瓜灰霉病的防病效果测定结果表明,发酵液处理的防病效果最佳,其次为抗菌素和芽孢稀释溶液处理,且两者效果差异不显著。稀释50倍的发酵液、稀释10倍的抗菌素、108cfu/m L芽孢稀释溶液的效果最好,防病效果分别达到了62.3%、52.9%、56.1%。枯草芽孢杆菌BSD-2及其抗菌物质处理后抗病相关防御酶和几丁质酶的测定结果显示,发酵液、抗菌素和芽孢稀释溶液处理能够提高POD、PPO、PAL、SOD的酶活性,且均在5天时达到酶活高峰,其中POD酶活性分别是对照处理的1.23、1.06、1.51倍;PPO酶活性在发酵液与抗菌素处理初期变化趋势明显,峰值为190U/g·min和170U/g·min,均达到对照处理的数值的3倍以上;PAL酶活性分别是对照组处理的1.68、1.67、1.68倍;SOD酶活性分别为对照处理的1.31、1.28、1.23倍。CAT酶活在发酵液和抗菌素处理后第3天时便达到峰值,活性分别达到103.5U/g·min和107.5U/g·min。发酵液、抗菌素、芽孢稀释溶液处理后几丁质酶活在11天时达到峰值,分别是对照的1.99、1.49、1.95倍。可见枯草芽孢杆菌BSD-2及其抗菌物质可以提高相关防御酶(POD、PPO、PAL、SOD、CAT)以及病程相关蛋白(几丁质酶),加快抗病相关物质的合成,进而诱导黄瓜植株产生抗病作用。发酵液、抗菌素、芽孢稀释溶液处理后叶片中的POD同工酶以及胞间隙蛋白测定结果显示,叶片中的POD同工酶表达发生变化,不仅表现在同种同工酶表达量的改变,同工酶种类也相应地增加。处理后胞间隙液中的几丁质酶酶活上升,在9天时分别达到为对照的1.32、1.39、1.46倍,且叶片胞间隙蛋白电泳中出现大小约为27k D的新增蛋白条带。可见BSD-2及其抗菌物质能够诱导植物自身防御基因与相关蛋白的表达,从而诱导黄瓜产生对灰霉病的抗病作用。初步建立了黄瓜叶片蛋白的双向电泳体系,分析BSD-2及其抗菌物质处理后的叶片蛋白变化。条件优化结果表明:丙酮/三氯乙酸法提取方法有利于获得丰富度较高的蛋白质溶液。300μg上样量、p H3-10的IPG预制胶条和25000Vhr的聚焦条件能够获得较为理想的双向电泳图谱。差异图谱显示部分蛋白出现了上调和下调的现象,说明枯草芽孢杆菌BSD-2及其抗菌物质处理后阻碍与减弱了正常的基因的表达或对相关基因启动和表达起到了诱导作用,为进一步解释诱导后植物体抗病机理与差异蛋白的结构、功能内在关系提供良好的基础。