研究背景卵巢癌是世界上最常见及致死率最高的妇科肿瘤疾病。尽管目前的治疗手段在卵巢癌的治疗方面取得了一定的疗效,然而卵巢癌患者的5年生存率仍然未达到30%。研究发现,极易转移和复发是影响卵巢癌患者预后的重要因素。近来研究发现,卵巢癌组织中存在一小部分具有干细胞特性的细胞,即卵巢癌干细胞(ovarian cancer stem cells,OCSCs),其与卵巢癌的发生发展,转移和预后密切相关。因此,阐明卵巢癌干细胞的调控机制对发展新的治疗策略及改善患者预后具有重要意义。与成体干细胞一样,肿瘤干细胞也生存在一个独特的微环境中,称为肿瘤干细胞巢(niche)。肿瘤干细胞巢由多种细胞组成,主要包括肿瘤细胞,基质细胞及免疫细胞等。干细胞巢内的各种细胞可通过分泌多种炎症因子调控肿瘤干细胞的生物学特性。大量研究发现,卵巢癌干细胞也受到来源于干细胞巢的多种炎症因子的调控(如IL-17等)。然而,关于卵巢癌干细胞自身调控机制尚缺乏深入系统的研究。在本课题组前期研究中,我们从卵巢癌细胞株A2780中成功分离了卵巢癌干细胞,并证实其具有无限自我更新,多向分化及体内成瘤等干细胞特性。为了全面地了解卵巢癌干细胞自我调控机制,我们还通过PCR-array的方法比较了CD133+卵巢癌干细胞和CD133-卵巢癌非干细胞中炎症因子及受体表达的差异。我们发现,除了已报道的IL-4,IL-8和LIF等因子外,仍有一些未报道的炎症因子在卵巢癌干细胞中也呈高表达。其中,S100B作为在两种细胞中表达差异最大的炎症因子,引起了我们的注意。S100家族包括21个EF手结构的Ca2+结合蛋白,S100B是其成员之一。S100B表达异常在神经系统疾病及多种肿瘤中均有报道。然而,其在肿瘤干细胞中的作用尚不清楚。以往文献报道,胞外S100B能够激活小神经胶质细胞中NF-κB信号通路,增强促炎症因子COX2的表达;而胞内S100B则可通过与p53蛋白的相互作用,抑制其磷酸化,从而影响p53的功能。NF-κB信号通路和p53蛋白在维持肿瘤干细胞自我更新中均发挥重要作用。因此,本研究在前期研究的基础上,深入阐明了S100B对卵巢癌干细胞的调控作用及分子机制。研究目的1.检测S100B在卵巢癌组织及卵巢癌干细胞中的表达情况。2.研究S100B对卵巢癌干细胞干性的调控作用。3.阐明S100B调控卵巢癌干细胞干性的具体分子机制。研究方法1.检测S100B在卵巢癌组织及卵巢癌干细胞中的表达情况:免疫组织化学染色检测人卵巢癌组织与对应癌旁组织中S100B的表达,并通过GEO数据库分析比较人卵巢癌组织与非肿瘤组织中S100B的表达差异;通过GEO数据库分析卵巢癌组织中S100B的表达与肿瘤临床分期及患者生存期之间的相关性,采用Real-time PCR的方法检测卵巢癌标本中S100B的表达,并分析其与肿瘤分化程度的相关性;采用Real-time PCR,Western blot和免疫荧光染色比较细胞株和原代肿瘤组织来源的卵巢癌干细胞与非干细胞之间S100B的表达差异,并采用免疫荧光染色的方法观察原代肿瘤中S100B与CD133的共表达情况。2.研究S100B对卵巢癌干细胞干性的调控作用:(1)构建S100B sh RNA慢病毒转染细胞株和原代肿瘤组织来源的卵巢癌干细胞,Real-time PCR和Western blot检测S100B的敲降情况;体外成球实验检测S100B敲降对卵巢癌干细胞的自我更新能力的影响;裸鼠皮下移植瘤实验观察S100B敲降对卵巢癌干细胞体内成瘤能力的影响,流式细胞术检测移植瘤中CD133的比例变化;并通过Western blot和免疫荧光染色检测S100B敲降后卵巢癌干细胞及其形成移植瘤中Nanog,Oct4和Sox2等干性标志物的表达情况。(2)构建S100B过表达慢病毒转染卵巢癌细胞株A2780,Western blot检测S100B过表达情况;体外成球实验检测S100B过表达后A2780细胞的自我更新能力的变化,流式细胞术检测细胞株中CD133+细胞的比例变化;裸鼠皮下移植瘤实验观察S100B过表达对A2780细胞体内成瘤能力的影响,免疫荧光检测移植瘤中CD133的比例变化;并通过Western blot和免疫荧光染色检测S100B敲降后卵巢癌干细胞及其形成的移植瘤中Nanog,Oct4和Sox2等干性标志物的表达情况。3.阐明S100B调控卵巢癌干细胞干性的具体分子机制:(1)采用流式细胞术和免疫荧光染色的方法检测卵巢癌干细胞和非干细胞中S100B的受体-晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)的表达情况;采用RAGE阻断受体阻断S100B-RAGE信号通路后,体外成球实12验观察卵巢癌干细胞的自我更新能力的改变;采用Western blot的方法检测S100B敲降后卵巢癌干细胞中NF-κB信号通路的活化情况。(2)Western blot检测S100B敲降后A2780来源和原代肿瘤组织来源的卵巢癌干细胞中p53及磷酸化p53的表达情况,并进一步检测其形成移植瘤中p53和磷酸化p53的表达情况;western blot检测S100B过表达后A2780细胞中p53和磷酸化p53的表达情况;western blot检测卵巢癌患者原代肿瘤组织中S100B与p53及磷酸化p53的表达是否相关;构建p53 sh RNA慢病毒载体转染S100B敲降的卵巢癌干细胞,western blot检测p53敲降后,S100B敲降的卵巢癌干细胞中p53,磷酸化p53及干性标志物的表达情况;体外成球实验检测p53敲降后,S100B敲降的卵巢癌干细胞自我更新能力的改变情况。研究结果1.S100B在卵巢癌组织中呈高表达,且与卵巢癌分期,分化程度及患者预后相关。我们采用免疫组织化学染色的方法检测了10例人卵巢癌组织及其癌旁组织中S100B的表达,发现S100B在肿瘤组织中的表达明显高于癌旁组织。通过分析GEO数据库,我们也发现卵巢癌组织中S100B的表达明显高于非肿瘤组织。之后我们通过分析GEO数据库,我们发现,S100B表达与卵巢癌分期呈明显正相关,而与患者生存期也呈明显负相关。我们用Real-time PCR检测了15例分化程度不同的卵巢癌组织中S100B的表达,结果发现分化程度高的卵巢癌组织中S100B表达低,反之亦然。2.S100B主要表达于卵巢癌干细胞。我们采用Real-time PCR,western blot和免疫荧光染色的方法检测了A2780及其来源的卵巢癌干细胞中S100B的表达情况,结果发现无论是m RNA水平还是蛋白水平,卵巢癌干细胞中S100B的表达明显高于非干细胞。之后我们从人原代卵巢癌组织中分离了卵巢癌干细胞和非干细胞,并通过Real-time PCR和western blot的方法检测了其中S100B的表达情况,结果发现原代来源的卵巢癌干细胞中S100B的表达也明显高于非干细胞。最后,我们采用免疫荧光的方法检测了人卵巢癌标本中S100B与CD133的共表达情况,结果发现S100B与CD133呈明显共表达,这进一步说明S100B在卵巢癌组织中主要表达于肿瘤干细胞上。3.S100B的敲降明显抑制了卵巢癌干细胞的成球能力,体内成瘤及干性标志物的表达。为了了解S100B在卵巢癌干细胞中的作用,我们采用慢病毒转染的方式干扰细胞株和原代肿瘤组织来源的卵巢癌干细胞中S100B的表达,Real-time PCR和western blot结果显示转染后卵巢癌干细胞中S100B表达明显降低,提示转染成功。之后我们观察了S100B敲降对卵巢癌干细胞自我更新能力,体内成瘤及干性标志物的表达的影响。成球实验发现S100B敲降后卵巢癌干细胞成球数量及大小明显下降;裸鼠皮下移植瘤模型也发现S100B敲降后卵巢癌干细胞成瘤能力明显下降,流式细胞术检测发现其移植瘤中CD133+细胞比例也明显下调;Western blot和免疫荧光结果发现,S100B敲降后卵巢癌干细胞及其形成的移植瘤中Nanog,Oct4和Sox2等干性标志物的表达也明显下调。4.S100B过表达可促进卵巢癌细胞株的干性为了进一步了解S100B对卵巢癌干细胞的调控作用,我们采用慢病毒转染的方法在卵巢癌细胞株A2780中过表达了S100B,Western blot验证了S100B的过表达情况。之后我们进一步观察了S100B过表达对A2780细胞体外成球、体内成瘤及干性标志物表达的影响。成球实验发现S100B过表达后,A2780细胞成球能力明显增强,而且其中CD133+细胞比例也明显上调;裸鼠皮下移植瘤模型也发现S100B过表达后A2780细胞成瘤能力明显增加;Western blot和免疫荧光结果发现,S100B过表达后A2780细胞及其形成的移植瘤中Nanog,Oct4和Sox2等干性标志物的表达也明显上调。5.S100B调控卵巢癌干细胞的干性依赖于p53活性抑制为了阐明S100B调控卵巢癌干细胞干性的具体分子机制,我们首先检测了S100B受体-RAGE在卵巢癌干细胞中的表达情况。流式细胞术和免疫荧光结果发现,卵巢癌干细胞上几乎不表达RAGE。之后我们进一步采用抗体阻断的方式检测了RAGE阻断对卵巢癌干细胞自我更新的影响,结果发现RAGE阻断并不影响卵巢癌干细胞的成球。此外,我们还检测了S100B敲降是否影响S100B-RAGE下游信号通路NF-κB,western blot结果发现S100B敲降后卵巢癌干细胞中NF-κB信号通路的活化并无明显改变。这些结果说明S100B对卵巢癌干细胞的调控作用不依赖于S100B-RAGE-NF-κB信号通路。为了进一步阐明S100B调控卵巢癌干细胞干性的具体分子机制,我们检测了卵巢癌干细胞中S100B对p53蛋白的调控作用。Western blot结果发现,S100B敲降可明显增加卵巢癌干细胞中p53和磷酸化p53的表达,而S100B过表达则明显抑制了卵巢癌细胞株A2780中p53和磷酸化p53的表达。我们还发现,在原代卵巢癌组织中,S100B的表达与p53及磷酸化p53的表达呈负相关。之后我们采用慢病毒转染的方法敲降了卵巢癌干细胞中的p53,进一步观察S100B调控卵巢癌干细胞干性是否依赖于p53的失活。Western blot结果发现,p53敲降可部分恢复S100B敲降引起的卵巢癌干细胞中干性标志物的表达下调。而且,成球实验也发现,p53敲降可部分恢复S100B敲降引起的卵巢癌干细胞自我更新能力的下降。这些结果说明100B对卵巢癌干细胞的调控作用依赖于p53的失活。研究结论本研究从卵巢癌干细胞自我调节的角度出发,揭示了S100B-p53通路在卵巢癌干细胞干性调控的重要作用。研究发现,S100B在卵巢癌组织中尤其是卵巢癌干细胞上呈高表达。S100B的表达与肿瘤干细胞标志物(CD133,Nanog和Oct-4)的表达呈正相关。阻断S100B后,卵巢癌干细胞的自我更新能力,成瘤能力及干细胞标志物表达明显下降;S100B过表达则可诱导卵巢癌细胞具有类似干细胞特性。S100B介导卵巢癌干细胞的干性维持不依赖于RAGE-NF-κB通路的激活,而是通过抑制p53蛋白的表达及活化来实现的。本研究深入阐明了S100B在卵巢癌干细胞自我调控中的作用及机制,并为针对卵巢癌干细胞的治疗提供了新的分子靶点。