论文部分内容阅读
目的:本实验拟通过研究Syk与MDA-MB-231细胞株IL-2受体表达之间的相互影响,来探讨其相关信号转导途径,从而初步研究乳腺癌细胞中IL-2受体信号转导通路的的作用机制和进一步揭示Syk的抑癌作用的实质。方法:1用逆转录-聚合酶链式反应(revers transcription PCR,RT-PCR)、蛋白质印记技术(Western blot)分别检测乳腺癌细胞MDA-MB-231中Syk和IL-2受体(α、β、γ亚基)的表达。采用RT-PCR和ELISA方法检测乳腺癌细胞MDA-MB-231中内分泌型IL-2的表达。2采用MTT法分析不同浓度人重组IL-2(rhIL-2)对MDA-MB-231细胞增殖反应的影响。用流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析rhIL-2对MDA-MB-231细胞周期、凋亡的影响。用RT-PCR方法检测不同浓度rhIL-2作用乳腺癌细胞MDA-MB-231 48h后对IL-2R转导通路下游相关基因STAT5表达的影响。3 pcDNA3.1D/V5-His-TOPO/syk真核表达载体的构建,以脂质体介导法将pcDNA3.1D/ V5-His-TOPO/syk真核表达载体转染Syk缺失的人乳腺癌细胞MDA-MB-231,经G418筛选,构建syk基因稳定表达的细胞株MDA-MB-231/syk.通过Western blot和RT-PCR技术,验证Syk在转染后的乳腺癌细胞中的表达情况。通过Western blot和RT-PCR方法检测转染syk cDNA前后乳腺癌细胞MDA-MB-231中IL-2受体的表达变化。用RT-PCR方法检测转染syk cDNA前后乳腺癌细胞MDA-MB-231中IL-2R转导通路下游相关基因STAT5的表达变化情况。4采用MTT法分析不同浓度rhIL-2对转染syk cDNA前后乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖反应的影响。5 RNA干扰沉默IL-2Rβ的表达对syk基因表达的影响:采用RNAi技术,特异性沉默MDA-MB-231/syk细胞中IL-2Rβ的表达。应用Western blot、RT-PCR方法筛选最有效抑制IL-2Rβ表达的质粒表达载体用于后续实验。应用Western blot、RT-PCR方法检测RNA干扰对syk基因表达的影响。结果:1通过RT-PCR、Western blot方法检测,结果显示MD A-MB-231细胞Syk表达阴性,而MDA-MB-231细胞IL-2受体β、γ表达阳性,且γ链的表达要强于β链的表达。两种方法均未检测出α链的表达。RT-PCR和ELISA方法检测乳腺癌细胞MDA-MB-231中内分泌型IL-2的表达阴性。2 MTT检测结果显示,不同浓度的rhIL-2(50、100、250、500、1000、2500、5000、10000u/ml)对MDA-MB-231细胞增殖有明显抑制作用,药物处理组与对照组比较有显著性差异(P<0.05),高浓度组与低浓度组比较,对MDA-MB-231细胞抑制作用有明显差异(P<0.05),抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性。FCM结果显示IL-2可诱导MDA-MB-231细胞周期阻滞和细胞凋亡。100、500、2500u/ml的rhIL-2作用MDA-MB-231细胞48 h后,G0/G1期细胞增多(P<0.05),而S期细胞减少(P<0.05)。IL-2可以剂量依赖性地诱导MDA-MB-231细胞凋亡,细胞凋亡率随明显rhIL-2浓度升高而增大,与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。RT-PCR结果显示rhIL-2作用48 h后,MDA-MB-231细胞STAT5基因转录水平明显下降。3通过RT-PCR、Western blot方法检测到了MDA-MB -231/syk细胞稳定表达Syk蛋白。通过RT-PCR、Western blot方法检测结果显示转染后IL-2Rβ链表达增强。用RT-PCR方法检测结果显示转染后MDA-MB-231细胞STAT5基因表达降低,结果有显著性差异(P<0.05)。4 MTT检测结果显示不同浓度rhIL-2对转染syk cDNA后乳腺癌细胞MDA-MB-231的生长抑制作用明显增强,与转染前相比,结果有显著性差异(P<0.05)。5结果显示RNAi技术有效沉默MDA-MB-231/syk细胞中IL-2Rβ的表达。Western blot、RT-PCR方法检测结果显示RNA干扰下调了syk基因的表达,结果有显著性差异(P<0.05)。结论:1 MDA-MB-231细胞Syk表达阴性,IL-2受体β、γ表达阳性,且γ链的表达要强于β链的表达。。2 rhIL-2对MDA-MB-231细胞的增殖有一定的抑制作用,并且可以下调STAT5的表达。3转染Syk基因后可以上调MDA-MB-231细胞中IL-2Rβ链的表达,下调STAT5基因表达。4转染Syk基因可以增强rhIL-2对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用。5 RNAi技术通过有效沉默IL-2Rβ链的表达,可以下调Syk基因的表达。提示Syk的抗肿瘤机制可能与IL-2受体信号转导通路有关。