小鼠2-细胞胚胎玻璃化冷冻保存技术的研究

来源 :中国农业大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:chaofree900521
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本试验以毒性低、渗透性较强的乙二醇和DMSO为主体,添加聚蔗糖、蔗糖配制的玻璃化溶液(EFS30、EFS40、EDFS30和EDFS40),在室温(20℃和25℃)下利用细管法,以及在25℃和37℃恒温台条件下OPS法对小鼠2-细胞胚胎进行玻璃化冷冻保存,并对解冻后胚胎的体外培养、囊胚细胞计数及胚胎移植技术进行了研究。 抗冻保护剂对小鼠2-细胞胚胎的毒性试验表明,25℃室温条件下胚胎在PBS液中平衡20min经培养囊胚发育率为70.73%、在0.5mol/L的蔗糖液中平衡5~20min经培养囊胚发育率为65.71%~58.33%、在FS液中平衡5~20min、在10%EG和1O%E+10%D溶液中平衡5~20min经培养囊胚发育率为61.54%~57.14%,表明这些物质对胚胎发育均几乎无影响。小鼠2-细胞胚胎在玻璃化溶液(EFS、EDFS)中平衡0.5min,其囊胚发育率为61.53%~62.50%;平衡时间为1min,囊胚发育率为60.00%~60.42%;平衡时间为2min,囊胚发育率为56.25%~61.70%;平衡5min,其囊胚发育率为47.5%~59.09%;平衡时间延长到10~20min,囊胚发育率下降到47.62%~0%。 小鼠2-细胞细管法和OPS法玻璃化冷冻保存试验表明:在20℃室温条件下,用EFS40平衡1 min细管一步法冷冻·解冻后,经培养其囊胚发育率仅为35.00%,和新鲜2-细胞胚胎体外培养的对照组(65.00%)的差异极显著(P<0.01)。当2-细胞胚胎在10%E+10%D溶液中预处理5min,再移入EDFS中平衡30s二步法冷冻保存,解冻后囊胚发育率达47.72%~48.78%;当室温升至25℃时,二步法冷冻保存后2-细胞的囊胚发育率达到52.17%,与对照组无显著差异(P>0.05)。改用OPS二步法EFS30冷冻组保存后的2-细胞胚胎的囊胚发育率高达62.22%,为试验中的最佳组。用细管法和OPS法最佳冷冻组胚胎解冻后培养至桑椹胚移植给受体母鼠均获得产仔。 在25℃温度条件下细管法和OPS二步法玻璃化冷冻后的小鼠2-细胞胚胎,经培养发育至囊胚后,用H33342染色,在荧光显微镜下观察并进行细胞计数。结果表明:细管法和OPS法玻璃化冷冻组的囊胚细胞数(47.25±6.81;55.42±8.96)与鲜胚的囊胚细胞数(67.43±9.05)相比差异不显著(P>0.05)。
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