【摘 要】
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目的慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)最主要的危险因素,HBX基因突变常在HBV相关的HCC患者的血清和肝癌组织中被检测到,并且这些突变与HCC进展密切相关,但突变在HCC发生发展中的作用机制尚未明确。本研究在前期研究的基础上,通过分析HBX G1461C和C1653T突变对Hep G2细胞生物学
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目的慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)最主要的危险因素,HBX基因突变常在HBV相关的HCC患者的血清和肝癌组织中被检测到,并且这些突变与HCC进展密切相关,但突变在HCC发生发展中的作用机制尚未明确。本研究在前期研究的基础上,通过分析HBX G1461C和C1653T突变对Hep G2细胞生物学功能的影响,同时在m RNA和蛋白水平检测GRP78、IRE1、ATF6、PERK、CHOP的表达来评估G1461C和C1653T突变是否对内质网应激产生影响。方法1、人工合成HBX-G1461C、HBX-C1653T、HBX-G1461C/C1653T突变序列以及HBX-wt野生序列,然后将其克隆入真核表达载体GV657,通过脂质体转染的方法将重组载体转染肝癌Hep G2细胞,同时以转染GV657空白载体作为对照,最后通过嘌呤霉素筛选稳定表达HBx蛋白的Hep G2细胞,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)的方法分别检测各组细胞HBX m RNA和HBx蛋白的表达情况。2、采用CCK-8法检测细胞的增殖能力;细胞克隆形成能力通过平板克隆形成实验检测;采用流式细胞术检测细胞周期与凋亡;采用划痕实验和Transwell小室实验检测细胞的迁移和侵袭能力,进而分析HBX G1461C和C1653T突变对肝癌Hep G2细胞生物学功能的影响。3、采用q RT-PCR和WB的方法分别检测内质网应激相关基因GRP78、IRE1、ATF6、PERK、CHOP的m RNA和蛋白的表达情况,初步分析HBX G1461C和C1653T突变是否能影响肝癌Hep G2细胞的内质网应激。结果1、q RT-PCR和WB结果显示,HBX-G1461C、HBX-C1653T、HBX-G1461C/C1653T、HBX-wt转染组细胞均有HBX m RNA及蛋白的表达,而GV657空白载体组均无表达。2、CCK-8实验结果显示,各组细胞OD值总体比较差异具有统计学意义(P<0.05);转染了HBX基因的各组细胞增殖能力均强于GV657空白载体组(P<0.05);除了HBX-G1461C突变转染组细胞外,HBX-C1653T和HBX-G1461C/C1653T突变转染组细胞增殖能力均明显强于HBX-wt转染组细胞(P<0.05),并且HBX-C1653T突变转染组细胞增殖能力最强(P<0.05)。平板克隆形成实验的结果与CCK-8实验结果一致。3、流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡结果显示,各组细胞之间周期的各时期比例以及各组细胞间的凋亡率差异均无统计学意义(P>0.05)。4、Transwell迁移和侵袭实验结果显示,HBX-C1653T和HBX-G1461T/C1653T突变转染组体外迁移和侵袭能力比HBX-wt转染组强(P<0.05),并且HBX-C1653T突变转染组体外迁移和侵袭能力最强(P<0.05);而HBX-G1461C、HBX-wt、GV657空白载体转染组三组间体外迁移和侵袭能力无明显差别(P>0.05)。5、划痕实验结果显示,转染了HBX基因的各组细胞划痕愈合指数比GV657空白载体转染组高,差异有统计学意义(P<0.05);除了HBX-G1461C突变转染组细胞外,其余两突变转染组细胞划痕愈合指数均高于HBX-wt转染组细胞(P<0.05),并且HBX-C1653T突变转染组细胞划痕愈合指数最高(P<0.05)。6、q RT-PCR和WB的方法分别检测内质网应激相关基因和蛋白的结果显示,在转录水平和翻译水平上,各组细胞GRP78、IRE1、ATF6、PERK、CHOP的表达均无显著差异(P>0.05)。结论1、相较于GV657空载体转染的肝癌Hep G2细胞,HBX基因突变能够促进细胞增殖、迁移和侵袭,但在细胞周期和细胞凋亡上无明显差别。2、相较于HBX野生型基因,G1461C突变对肝癌Hep G2细胞生物学功能的影响不明显;G1653T和G1461C/C1653T突变能明显促进肝癌Hep G2细胞增殖、迁移和侵袭。3、在所有突变组中,C1653T突变对肝癌Hep G2细胞的影响最显著,提示G1461C和C1653T在细胞增殖、迁移和侵袭等细胞功能学上存在潜在的拮抗作用。4、本研究尚未发现HBX G1461C和C1653T突变能影响肝癌Hep G2细胞的内质网应激。
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