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本试验旨在比较藏猪和DLY猪抗病毒相关模式识别受体基因表达差异,探明VD的抗病毒效果及其对基因表达的影响,以揭示不同品种猪抗病力差异和VD抗病的分子机制。首先应用生物信息学和荧光定量方法,在克隆了藏猪维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)、β干扰素启动子刺激分子1(IPS-1)、Toll样受体3(TLR3)基因cDNA序列基础上,研究了RIG-Ⅰ、IPS-1和TLR3基因在藏猪和DLY猪不同组织的表达差异；然后建立了PRRS弱毒苗攻毒模型,研究藏猪和DLY猪抗病毒先天性免疫应答的差异；最后通过体外和体内试验探索了VD的抗病毒作用及其分子机制。本研究包括以下四个试验：试验一DLY猪和藏猪RIG-Ⅰ、IPS-1和TLR3基因表达差异的研究选取同一生长阶段、体重相近的纯种藏猪和DLY杂交猪各6头(公母各半),屠宰后取其心、肝、脾、肺、肾、十二指肠、空肠、回肠、支气管淋巴结、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结、肌肉和脂肪等组织,提取总RNA,克隆藏猪RIG-Ⅰ、IPS-1和TLR3基因cDNA序列,用Real-time PCR方法检测RIG-Ⅰ、IPS-1和TLR3mRNA表达水平。结果如下：(1)藏猪RIG-Ⅰ基因cDNA序列长2832bp,包含从起始密码子1位到终止密码子2832位的开放阅读框,编码943个氨基酸残基,核苷酸序列与已报道猪的相似性为99.58%,氨基酸序列与人和鼠的相似性分别为77.67%和71.85%,不含跨膜区域。(2)藏猪IPS-1基因cDNA序列长1575bp,包含从起始密码子1位到终止密码子1575位的开放阅读框,编码524个氨基酸残基,核苷酸序列与已报道猪的相似性为99.37%,氨基酸序列与人和鼠相似性分别为55.04%和45.03%,含一个跨膜区域。(3)藏猪TLR3基因cDNA序列长2718bp,包含从起始密码子1位到终止密码子2718位的开放阅读框,编码901个氨基酸残基,核苷酸序列与已报道猪的相似性为99.56%,氨基酸序列与人和鼠相似性分别为83.43%和77.35%,含一个跨膜区域。(4)所有组织均能检测到RIG-Ⅰ、IPS-1和TLR3mRNA表达。藏猪大部分组织的RIG-!和IPS-1mRNA水平均高于DLY猪(P<0.01)。RIG-Ⅰ和TLR3基因在藏猪肝和十二指肠的表达量最高,RIG-Ⅰ和TLR3基因在DLY猪肝、空肠、肝和肾表达量最高。藏猪和DLY猪的IPS-1基因均在肝和肾表达量最高。试验二PRRS弱毒苗对DLY猪和藏猪RIG-Ⅰ、IPS-1和TLR3基因表达的影响选用同一生长阶段、体重相近的纯种藏猪(15.44±0.34kg)和DLY (15.21±0.30kg)猪各12头,试猪单笼饲养。试验采用2×2因子试验设计,分别为藏猪与DLY猪,PRRS弱毒苗攻毒与不攻毒。试验分为4处理,每个处理6个重复,每个重复1头猪。试验预试期7d,正式期13d。第14d早上空腹采血后屠宰。结果如下：(1)DLY猪的日增重高于藏猪(P<0.01), PRRS弱毒苗攻毒降低了DLY猪和藏猪的日增重和日采食量(P<0.01),提高了饲料增重比(P<0.01),对DLY猪生产性能的影响强于藏猪(P<0.01)。(2) PRRS弱毒苗攻毒提高两种猪血清中免疫球蛋白IgG和IgM的浓度(P<0.01),但与品种之间无交互效应(P>0.05)。(3) PRRS弱毒苗攻毒提高了细胞因子IL-1β(P<0.01)、TNF-α (P<0.05)和IFN-β(P<0.05)的浓度,对DLY猪血清中IL-1p和IFN-β的影响强于藏猪(P<0.05)。(4) PRRS弱毒苗攻毒能提高RIG-Ⅰ在脾(P<0.01)、肝(P<0.05)、肺(P<0.01)、支气管淋巴结(P<0.05)、肠系膜淋巴结(P<0.01)、腹股沟淋巴结(P<0.01)、空肠(P<0.01)和回肠(P<0.01)的表达,提高IPS-1在脾(P<0.01)、肝(P<0.01)、肺(P<0.01)、肠系膜淋巴结(P<0.01)、空肠(P<0.01)和回肠(P<0.05)的表达,提高TLR3在脾(P<0.01)、肝(P<0.01)、肺(P<0.05)、肠系膜淋巴结(P<0.01)、腹股沟淋巴结(P<0.01)、空肠(P<0.01)和回肠(P<0.01)的表达。(5) PRRS弱毒苗攻毒对DLY猪肺(P<0.01)、肠系膜淋巴结(P<0.05)和回肠(P<0.01)组织RIG-Ⅰ mRNA表达的影响强于藏猪；对DLY猪肝(P<0.01) IPS-1mRNA表达的影响强于藏猪；对DLY猪腹股沟淋巴结(P<0.01) TLR3mRNA表达的影响强于藏猪。试验三VD对感染RV IPEC-J2细胞系RIG-Ⅰ、IPS-1和TLR3基因表达与IFNβ蛋白表达的影响为了考察VD的抗病毒作用及其信号机制。本试验选用猪IPEC-J2细胞系为研究模型。病毒为猪轮状病毒OSU株。试验采用2x2x2因子试验设计,分别为感染RV与不感染,加入生理浓度(10-7M)25D3与不加25D3,加入CYP27B1酶阻断剂依曲康唑(ITRA,10-7M)与不加ITRA,,每个处理6个重复。24h后,提取总RNA,考察RIG-Ⅰ及其下游信号分子、TLR3mRNA表达,ELISA考察IFN-α蛋白含量。结果如下：(1)研究建立了RV感染IPEC-J2细胞模型。结果表明：RV感染IPEC-J2细胞24h后细胞体积缩小,连接消失,与周围的细胞脱离呈网状结构,当感染72h后细胞圆缩、坏死、脱落。通过MTS法检测细胞的增殖情况,RV感染极显著降低了细胞的增殖。RT-PCR检测感染RV的细胞均检测到RV RNA的存在。(2)RV感染提高了IPEC-J2细胞CYP27B1mRNA表达和上清液中1,25D3水平(P<0.01)。(3)RV感染提高RIG-Ⅰ、IPS-1、ISG15和IFN-β mRNA的表达(P<0.01),对TLR3mRNA的表达无显著影响(P>0.05)。VD提高RV感染IPEC-J2细胞RIG-Ⅰ、 IPS-1、ISG15和IFN-βmRNA的表达(P<0.01)。RV感染和VD互作对RIG-Ⅰ、IPS-1、 ISG15和IFN-p mRNA表达有显著影响,VD提高RIG-Ⅰ、IPG15和IFN-β mRNA表达的程度为感染组高于未感染组(P<0.01)。RV感染提高了IFN-β蛋白水平(P<0.01),VD提高了IFN-β蛋白水平(P<0.01),RV和VD互作对IFN-β蛋白有显著影响,VD提高IFN-β蛋白的程度为感染组高于未感染组(P<0.01)。试验四VD对感染RV藏猪和DLY猪肠道TLR3和RIG-Ⅰ及下游信号分子基因表达的影响为了考察动物试验中VD对RIG-Ⅰ及下游信号分子和TLR3基因表达的影响。选用同一生长阶段体重为13.73±0.95kg的纯种藏猪16头和DLY猪(26.46±2.07kg)24头,试猪单笼饲养。试验采用2×2x2因子试验设计,分别为藏猪与DLY猪,感染RV与不感染,基础日粮(VD为NRC水平)与基础日粮添加VD(VD为25倍NRC水平)。试验分为8个处理,藏猪每个处理4个重复,每个重复1头猪,DLY猪每个处理6个重复,每个重复1头猪。试验预试期7d,正式期6d,第7d早上空腹采血后屠宰。结果如下：(1)RV攻毒降低了猪平均日增重和日采食量(P<0.01),提高了料重比(P<0.01)；日粮添加VD提高了平均日增重和日采食量(P<0.01),对料重比无显著影响；RV攻毒对DLY猪生产性能的影响强于藏猪(P<0.01)。(2)RV攻毒降低了绒毛高度(P<0.01),对隐窝深度和绒隐比无显著影响；日粮添加VD有提高绒毛高度的趋势,但差异不显著,对隐窝深度和绒隐比无显著影响。品种和RV攻毒的互作对绒毛高度有显著影响,RV攻毒降低绒毛高度的程度为DLY猪显著高于藏猪。(3)RV攻毒提高了血清中IFN-β、IL-6和IL-2水平(P<0.01)；添加VD提高了血清IFN-β水平(P<0.01),降低了血清中1L,-6和IL-2水平(P<0.01)；品种与RV攻毒互作对IFN-β、IL-6和IL-2有显著影响,RV攻毒提高IFN-β、IL-6和IL-2的程度均为DLY猪高于藏猪(P<0.01)。(4)RV攻毒提高了十二指肠、空肠和回肠CYP27B1mRNA表达(P<0.01)；日粮添加VD提高了十二指肠、空肠和回肠CYP27B1mRNA表达(P<0.01),提高十二指肠CYP27B1mRNA表达的程度为DLY猪高于藏猪(P<0.01)；RV攻毒降低了血清中1,25D3水平(P<0.01)；添加VD提高了血清中1,25D3水平(P<0.01)。(5)RV攻毒提高了十二指肠、空肠和回肠RIG-Ⅰ、IPS-1、ISG15和IFN-β mRNA表达(P<0.01),对十二指肠、回肠TLR3mRNA表达无显著影响；日粮添加VD提高了十二指肠、空肠和回肠RIG-Ⅰ、IPS-1、ISG15和IFN-β mRNA表达(P<0.05),对十二指肠、空肠和回肠TLR3mRNA表达均无显著影响。综上所述,抗病力不同的藏猪和DLY猪体内RIG-Ⅰ、IPS-1和TLR3的表达水平存在明显的品种和组织差异；藏猪具有较强的疾病抵抗力可能与这些基因表达量高有关；VD具有一定的抗病毒功能,其机制与调节这些基因表达有关,且RIG-Ⅰ信号途径是其实现抗病毒作用的信号转导通路之一。