神经胶质瘤是起源于中枢神经系统胶质细胞的原发性肿瘤,是最常见的神经系统肿瘤,占整个神经系统肿瘤的30%-45%,占中枢神经系统恶性肿瘤的80%以上。恶性胶质瘤的一个显著特征是浸润性生长,且生长速度快,导致胶质瘤和正常脑组织无明显边界,很难通过手术完全切除,术后易复发,预后差,生存期短。加之肿瘤位于中枢神经系统,患者还常常伴有神经功能障碍,往往会给其本人和家庭带来沉重负担,是对人类身心健康危害极大的疾病。HIV-1 Tat interactive protein 2,30 kDa (HTATIP2)是新近发现的一个与肺癌转移相关的抑癌基因,它位于人类11号染色体短臂(1 1p15.1),含有一个开放阅读框,其中共包含6个外显子,可以编码242个氨基酸残基组成的蛋白,相对分子量30000,具有较强的保守性。目前已经证实,HTATIP2在多种肿瘤中表达减少,而且HTATIP2能通过参与抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,调节肿瘤代谢,调节DNA损伤修复,抑制细胞迁移和侵袭等过程发挥其抑癌作用。因此,对HTATIP2进行深入研究可能对研发胶质瘤的基因治疗有所帮助。本研究利用第三代慢病毒包装过表达HTATIP2病毒颗粒,感染人胶质瘤细胞系,构建过表达HTATIP2的U87和U251细胞系。随后利用这些细胞系研究HTATIP2对人胶质瘤细胞的生长和增殖、凋亡、代谢、迁移和侵袭等方面的作用。最后,我们还分析了胶质瘤中HTATIP2的表达水平,探讨其可能的调控机制以及HTATIP2和胶质瘤患者临床病理特征之间的关系。第一章过表达HTATIP2的胶质瘤细胞系的构建及其鉴定目的：建立过表达HTATIP2的慢病毒载体,利用该载体感染人胶质瘤细胞系U87和U251,获得稳定表达HTATIP2的人胶质瘤细胞系,为进一步研究HTATIP2基因在胶质瘤中的作用奠定基础。方法：1.体外培养人宫颈癌细胞系Hela,提取细胞总RNA,使用逆转录的方法制备cDNA。以该cDNA为模板,通过PCR的方法钓取HTATIP2编码序列。2.构建过表达HTATIP2的载体pLJM1-HTATIP2。首先将钓取的HTATIP2编码序列DNA进行纯化,然后将此片段连接至pMD18-T载体中。连接反应结束后将其转化至DH5a感受态中,培养过夜后挑取单克隆菌进行鉴定,阳性克隆继续扩大培养后提取质粒。提取的质粒用限制性内切酶Age Ⅰ和EcoR Ⅰ进行双酶切。与此同时,对pLJM1-EGFP使用相同的限制性内切酶双酶切,前者产物电泳后回收含目的基因的DNA片段,后者回收骨架DNA片段。将回收的片段进行连接,连接反应结束后将其转化至DH5a感受态中,培养过夜后挑取阳性克隆菌进行鉴定。3.慢病毒包装。将第三代慢病毒包装系统以如下比例混合：pLJM1-EGFP或pLJMl-HTATIP210 μg, pMDLg/pRRE 6.53 μg, pRSV-Rev 2.32 μg, pMD2.G3.55μg,并将其转染进约70%汇合度的293T细胞中。继续培养48 h后,收集上清液,4000 rpm离心5 min后取上清液,并用0.45μm滤膜过滤后备用。4.使用Real Time qPCR的方法检测病毒滴度。将待测病毒液以10倍梯度倍比稀释,并加入细胞中培养48 h。提取总RNA做RT-qPCRo当某个浓度梯度中目的基因表达与对照组CT值相差大于2时,认为此样品中至少含1个病毒颗粒,根据公式计算病毒滴度。5.慢病毒感染人胶质瘤细胞系U87和U251。将包装好的病毒液加入细胞中培养,同时加入Polybrene增强感染。感染24h后更换新培养基,48 h加入嘌呤霉素进行筛选,并继续培养4-5 d。6. Real Time PCR和Western Blotting检测细胞中HTATIP2基因mRNA和蛋白表达水平。7.统计学方法：使用SPSS 20.0分析,计量资料以均数±标准差(X±s)表示,所有数据均为三次以上重复试验结果。当参照组数据为常数时,使用95%置信区间进行分析,若95%置信区间包含参照组常数,则差异无统计学意义,记为P>0.05,若不包含参照组常数,则差异有统计学意义,记为P<0.05。检验水准为a=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.成功获取含有HTATIP2编码序列的DNA片段2. PLJM1-HTATIP2载体鉴定：PCR检测发现,重组质粒组存在特异性条带,大小与设计长度相当。将重组载体用Age Ⅰ和EcoR Ⅰ进行双酶切反应后电泳,结果显示重组质粒在700 bp左右出现特异性条带,与编码序列长度相当,表明HTATIP2编码序列已插入pLJMl载体。对重组载体测序结果进行BLAST分析,结果显示与HTATIP2编码序列完全相符,表明pLJM1-HTATIP2载体构建成功。3.慢病毒滴度测定：通过Real Time qPCR方法检测病毒滴度,该结果显示pLJMl-EGFP和pLJM1-HTATIP2均在10-2μL组中CT值与对照组相差大于2,根据公式：1/(1.0E-02)×20计算的病毒滴度为大于2.0E+6 TU/mL。4.慢病毒感染人胶质瘤细胞U87和U25148 h后,Lv-EGFP病毒感染组可见绿色荧光表达,加入嘌呤霉素筛选培养4-5 d后,Lv-EGFP组细胞绿色荧光蛋白强阳性表达,Lv-HTATIP2组细胞生长状态良好,未感染的对照组细胞全部死亡。5. Real-Time qPCR检测病毒感染后的细胞中HTATIP2 mRNA的表达水平,发现Lv-HTATIP2病毒感染组中的mRNA水平高于Lv-EGFP组,其中U87相对表达量95%置信区间为(826.6,976.0),U251相对表达量95%置信区间为(733.7,836.1),与对照组相对表达量1相比,差异均有统计学意义(P<0.05),说明HTATIP2表达病毒进入细胞后转录增加。随后,我们又利用Western Blotting检测细胞其蛋白表达水平,结果显示Lv-HTATIP2感染组蛋白表达高于Lv-EGFP组,表明我们成功地建立了过表达HTATIP2的人胶质瘤细胞系U87-HTATIP2和U251-HTATIP2。结论：1.成功构建了pLJMl-HTATIP2慢病毒表达载体。2.成功包装了过表达HTTIP2的慢病毒颗粒。3.通过慢病毒感染,我们成功构建了稳定过表达HTATIP2的人胶质瘤细胞系U87-HTATIP2和U251-HTATIP2。第二章过表达HTATIP2对人胶质瘤细胞U87和U251的影响目的：利用第一章构建的过表达HTATIP2的人胶质瘤细胞系U87-HTATIP2和U251-HTATIP2,研究HTATIP2对胶质瘤细胞的增殖、凋亡、代谢以及肿瘤细胞迁移和侵袭的影响,为胶质瘤的基因治疗疗提供思路。方法：1.MTT法绘制生长曲线：将生长状态良好的U87-HTATIP和U251-HTATIP2以及对照组U87-EGFP和U251-EGFP细胞接种于96孔板,每孔接种3000个细胞,每组设置5个复孔,共接种5块板。培养24 h后加入20μL浓度为5mg/mL的MTT溶液,继续培养4h。4h后,弃去培养液,每孔加入150μLDMSO,室温下置于摇床上摇动10min以溶解甲瓒晶体,当完全溶解后,测定溶液在490nm处吸光度。每24h测定一次,共测5次。2.平板克隆形成实验评估细胞增殖：将生长状态良好的U87-HTATIP和U251-HTATIP2以及对照组U87-EGFP和U251-EGFP细胞接种于35mm细胞培养皿,每个细胞培养皿中接种200个细胞,使其分布均匀。然后将细胞置于细胞培养箱中培养2-3周,每3d更换一次培养液,当出现肉眼可见克隆时停止培养。然后用PBS清洗2-3次,甲醇固定20min,再用0.1%的结晶紫染色10min,洗净多余染液计数克隆个数。3.流式细胞仪分析细胞凋亡：将对数生长期的细胞传代培养,24h后收集全部细胞,制成细胞悬液,使用Annexin V/PE染料对细胞进行染色,之后使用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。4.检测细胞对低糖环境的耐受能力：将对数生长期细胞传代后接种于96孔板,24h后更换为低糖培养液(葡萄糖浓度为2.5mM),继续培养24h后使用MTT法检测细胞活力。5.测定细胞迁移能力：向Transwell小室下层加入600μL含10%FBS的高糖DMEM培养基,上层加入用无FBS的高糖DMEM重悬的含有5×104个细胞的细胞悬液100μL。然后置于细胞培养箱中培养12h。之后用棉签擦去上层细胞,用甲醇固定穿过膜的下层细胞,再用0.1%的结晶紫染色10min,显微镜下计数细胞数。6.测定细胞侵袭能力：将1：9稀释的Matrigel平铺于Transwell小室上层,置于37℃使其凝固。然后向小室下层加入600 μL含10% FBS的高糖DMEM培养基,上层加入100μL无高糖FBS的DMEM重悬的含有1×105个细胞的细胞悬液。然后置于细胞培养箱中培养24-48 h。之后用棉签擦去上层细胞,用甲醇固定穿过膜的下层细胞,再用0.1%的结晶紫染色10 min,显微镜下计数细胞数。7.使用Western Blotting检测细胞中Twistl和MMP-2基因表达情况。8.统计学方法：使用SPSS 20.0分析,计量资料以均数±标准差(X±s)表示,所有数据均为三次以上重复试验结果。对所测结果进行正态性检验和方差齐性检验,正态分布数据且方差齐时,两组间均数比较采用独立样本t检验,方差不齐时采用t’检验。非正态分布数据采用非参数秩和检验。细胞生长曲线采用析因设计方差分析。当参照组数据为常数时,使用95%置信区间分析,若95%置信区间包含参照组常数,则差异无统计学意义,记为P>0.05,若不包含参照组常数,则差异有统计学意义,记为P<0.05。检验水准为α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.细胞生长曲线显示,两组间细胞生长差异有统计学意义(U87:F=97.463, P<0.001, U251:F=50.098, p<0.001)。过表达HTATIP2的U87和U251细胞在培养24 h和48 h时与对照组细胞U87-EGFP和U251-EGFP之间490 nmOD值无显著性差异(24h U87:t=0.818, P=0.444; U251:t=-0.854, P=0.426; 48 h U87:t=1.295,p=0.243; U251:t=1.664,147)。从第72h开始,实验组和对照组之间开始出现显著性差异,差异有统计学意义(U87:t=6.156, P=0.001; U251:t=4.171,P=0.006),表明过表达HTATIP2能抑制胶质瘤细胞生长。2.平板克隆形成实验显示,U87-EGFP平均克隆形成数量为86.7±7.1个,多于U87-HTATIP2细胞的49.0±4.6个。类似地,U251-EGFP平均克隆形成数量为73.3±8.7个,也多于U251-HTATIP2的37.6±4.5个,二者差异均有统计学意义(U87:t=7.725, P=0.002; U251:t=6.283, P=0.003),说明HTATIP2能够抑制胶质瘤细胞克隆形成,抑制其增殖。3.流式细胞仪分析结果显示,U87-EGFP细胞多数位于十字门左下象限,即为正常活细胞,右下象限和右上象限基本无细胞,而U87-HTATIP2细胞除了部分位于左下象限外,右下象限细胞数量增多,提示细胞凋亡增加,U251细胞中表现与U87细胞类似,过表达HTATIP2的细胞凋亡数量显著高于对照组细胞,二者差异均有统计学意义,(U87:t=-10.607, P<0.001; U251:t=-9.584, P<0.001)。04.细胞低糖培养24 h后,U87-EGFP细胞490 nm处平均OD值为0.2960±0.082,而U87-HTATIP2细胞为0.2277±0.1518,低于对照组细胞,二者差异有统计学意义(t=6.864,P=0.002)。类似地,U251-EGFP细胞为0.2500±0.0139,高于U251-HTATIP2细胞的0.1913±0.0083,二者差异有统计学意义(t=6.274,P=0.003)。结果表明HTATIP2可以降低胶质瘤细胞对低糖环境的耐受力。5. Transwell实验显示,当小室未包被Matrigel时,U87-EGFP细胞12h穿过小室膜的数量为284.0±18.6个/视野,而U87-HTATIP2细胞数量少于对照组,为165.2±14.8个/视野,二者差异有统计学意义(t=11.179,P<0.001)。U251-EGFP细胞12h穿过小室膜的数量也多于U251-HTATIP2细胞,分别为每视野196.2±14.5个细胞和129.4±8.1个,差异有统计学意义(t=8.975,P<0.001)。当小室中预先包被Matrigel胶后,24-48 h穿过小室的U87-EGFP细胞为127.0±11.6个/视野,U251-EGFP细胞为62.4±9.2个/视野,比U87-HTATIP2的56.0±8.5个/视野和U251-HTATIP2的29.2±6.6个/视野多,二者均差异有统计学意义(U87：t=11.061,P<0.001和U251：t=6.562,P<0.001)。6.通过Western Blotting检测后发现过表达HTATIP2的U87和U251细胞中Twist1和MMP-2的蛋白表达减少,表明HTATIP2可以下调Twist1和MMP-2。结论：1.过表达HTATIP2可以抑制人胶质瘤细胞U87及U251生长。2. HTATIP2能够抑制人胶质瘤细胞U87及U251增殖能力。3. HTATIP2能够诱导人胶质瘤细胞凋亡。4. HTATIP2影响胶质瘤细胞能量代谢,降低肿瘤细胞对低糖环境的耐受性。5. HTATIP2能够抑制人胶质瘤细胞U87、U251迁移和侵袭。6. HTATIP2可以下调Twist1和MMP-2的表达。第三章HTATIP2在胶质瘤中的表达及其调控研究目的：分析人胶质瘤中HTATIP2的表达水平,研究其可能的调控机制,并探讨其与胶质瘤临床病理特征的关系。方法：1.将胶质瘤标本和对照正常脑组织制成石蜡包埋组织块,切片后进行免疫组化染色,通过阳性细胞数比例和组织染色强度确定HTATIP2表达水平,比较肿瘤和正常脑组织中HTATIP2表达是否存在差异。2.使用甲基转移酶抑制剂5-Aza-2’-deoxycytidine处理U87和U251细胞,然后通过RealTime PCR和Western Blotting检测HTATIP2的mRNA及蛋白表达水平。3.使用甲基化特异性PCR (MSP)和硫化测序(BSP)的方法分析U87和U251细胞启动子区甲基化的状态,利用双荧光素酶实验验证启动子甲基化对其启动活性的影响,使用MSP和焦磷酸测序分析胶质瘤和正常对照脑组织启动子区甲基化状态。4.分析胶质瘤患者临床病理特征,探究不同临床病理特征患者间HTATIP2表达及启动子甲基化状态是否存在差异。5.统计学方法：使用SPSS 20.0分析,计量资料以均数±标准差(X±s)表示,所有数据均为三次以上重复试验结果。对所测结果进行正态性及方差齐性检验,若符合正态分布且方差齐时,两组间均数的比较采用独立样本t检验,方差不齐则采用t’检验。若不符合正态性分布,两组间均数比较则使用秩和检验。三组以上均数比较,方差齐时采用one-way ANOVA, Post Hoc采用LSD法,方差不齐时采用Welch检验,Post Hoc采用Dunnett’s T3检验。方差分析时去掉常数组数据,若需与常数组比较则采用95%置信区间进行比较,若95%置信区间包含参照组常数,则差异无统计学意义,记为P>0.05,若不包含参照组常数,则差异有统计学意义,记为P<0.05。计数资料采用卡方检验或秩和检验。总生存期(Overall Survival, OS)的计算从手术后开始计算,直到患者死亡。若患者最后一次随访时未死亡,则记为删失数据。50例胶质瘤患者中13例失访,最终37例纳入研究。生存曲线采用Kaplan-Meier法进行绘制,组间总生存率比较采用log-rank检验。检验水准为a=0.05,以P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.石蜡切片免疫组化染色结果显示胶质瘤样本中HTATIP2表达水平显著低于正常脑组织(Z=-3.358,P=0.001)。除此此外,胶质瘤中HTATIP2缺失比例显著高于正常脑组织(Z=-2.338,P=0.019)。胶质瘤中HTATIP2弱表达比例高于正常脑组织,差异有统计学意义(Z=-2.137,P=0.033)。2.5-Aza-2dc处理U87和U251细胞之后,与对照组相比其HTATIP2的mRNA表达显著增加,95%CI均不包含对照组的相对表达量1,差异有统计学意义(U87:P<0.05; U251:P<0.05)。对于U87细胞,其不同浓度处理组间mRNA表达差异有统计学意义(Welch F=38.995, P<0.001),而U251细胞不同浓度处理组间mRNA表达差异无统计学意义(F=0.793,P=0.482)。该结果表明U87细胞mRNA表达随5-Aza-2dc浓度增加而增加,提示U87和U251细胞中HTATIP2启动子甲基化程度有差异。Western Blotting结果表明,5-Aza-2dc处理组细胞HTATIP2表达有所增加。3.MSP和BSP结果显示U87细胞HTATIP2启动子高度甲基化,U251细胞中也存在不同程度的甲基化。双荧光素酶实验结果表明pGL3-HTATIP2-pro组荧光素酶活性95%置信区间为(4.071,15.223),显著高于对照组pGL3-Basic(P<0.05),当给予其体外甲基化处理后,其荧光素酶活性为1.87±0.68,显著低于未甲基化的片段(LSD检验,P<0.001)。表明甲基化使HTATIP2启动子启动活性降低。4.MSP和焦磷酸测序结果表明,胶质瘤标本中HTATIP2启动子关键序列CpG二核苷酸存在不同程度的甲基化,除了CpG8 (Spl-4)外,均高于正常脑组织的甲基化水平,差异有统计学意义(CpG1,t=6.389, P<0.001; CpG2, Z=-2.521,P=0.012; CpG3,t=4.558, P<0.001; CpG4,t=5.221,P<0.001; CpG5, Z=-3.198, P=0.001; CpG7,t=5.563, p<0.001; CpG8,t=1.880,p=0.066; Average, t--5.701,P<0.001)。此外,HTATIP2表达缺失的胶质瘤组织甲基化程度比HTATIP2强表达的组织高,但差异无统计学意义(LSD检验,P=0.070),同时,对于Spl-1位点,前者甲基化水平式后者的2倍。差异也无统计学意义(LSD检验,P=0.050)。5. HTATIP2表达及其启动子甲基化状态在不同年龄、性别、肿瘤级别和肿瘤组织类型的胶质瘤患者中差异无显著性。HTATIP2启动子甲基化的患者中位生存期为27月,未甲基化的患者为37月,两组间总生存率差异无显著性(P=0.352), HTATIP2表达阳性的胶质瘤患者中位生存期为37月,HTATIP2表达阴性的患者中位生存期长为19月,HTATIP2表达阴性的患者总生存率低于HTATIP2表达阳性的患者(P=0.044)。结论：1. HTATIP2在人胶质瘤组织中表达减少或缺失。2.启动子甲基化可能是胶质瘤中调节HTATIP2表达的重要方式。3. HTATIP2表达阳性的胶质瘤患者生存期长于HTATIP2表达缺失的患者。