第一部分重组腺病毒介导的缺氧诱导因子-1α基因抗大脑皮层神经元缺氧的研究　　目的：探讨重组腺病毒介导的缺氧诱导因子-1α基因对大鼠大脑皮质神经元缺氧后的保护作用，为临床治疗缺血缺氧性脑血管病提供更多的实验依据。　　方法：制备大鼠大脑皮层神经元体外原代培养及缺氧的模型；倒置显微镜下观察正常和缺氧神经元的生长情况；免疫细胞化学鉴定大鼠大脑皮层神经元；将带有绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein，GFP）的重组腺病毒介导的缺氧诱导因子-1α基因（Recombinant adenovirus-mediated hypoxia inducible factor-1 alpha gene，AdHIF-1α）及重组腺病毒空载体（Recombinant adenovirus empty vector，Ad）转染缺氧的神经元，并分5个时间点（12h，24h，48h，72h及96h）在荧光显微镜下观察 AdHIF-1α及 Ad的转染效率；将实验神经元分为正常对照（Normoxia）组、缺氧（Hypoxia）组、 AdHIF-1α转染组及 Ad转染组，透射电镜下观察各实验组神经元超微结构的变化。　　结果：（1）神经元的原代培养：初种神经元2h开始贴壁，48h后可见大部分细胞贴壁，细胞形态比较单一，呈圆球形，偶见细胞长出突起。第5天神经元中混杂有较多的胶质细胞，换 N2培养液抑制杂质细胞的生长，培养至第11天，神经元生长旺盛，纯化率达95％以上。（2）免疫细胞化学鉴定：取培养至第11天的神经元，加入小鼠神经丝（Neurofilament，NF）抗体，二氨基联苯胺（Diaminobenzidine，DAB）染色，光镜下NF阳性神经元的细胞质和突起呈棕色或棕褐色，细胞核深染，形态呈圆形、圆锥形，从胞体伸出突起，并与周围细胞连接，突起多为单极或双极，证实所培养的细胞为皮层神经元。（3）缺氧模型的建立：将用于实验的神经元换用含100μmol/LCoCl2及2%胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）的DMEM培养液分别继续培养12h，24h，48h及72h，经过形态学观察和缺氧模型预实验，证实缺氧24h适合用作缺氧模型。（4）荧光显微镜下观察AdHIF-1α及Ad的转染效率：AdHIF-1α及Ad转染缺氧的神经元后，12h可见有少许荧光开始表达，24h荧光表达稍增加，48h荧光表达最明显，72h荧光表达下降，96h荧光表达微弱。（5）神经元超微结构变化的观察：透射电镜下Normoxia组神经元形态及染色质正常、内质网、线粒体等结构正常；Hypoxia组及 Ad组细胞水肿，细胞器破坏或消失；AdHIF-1α组细胞核形态结构及染色质分布未见明显异常，细胞器以线粒体、内质网为主，个别略显水肿。证实AdHIF-1α可改善缺氧对神经元细胞器的损伤，维持细胞结构的完整性。　　结论：（1）本实验研究所建立的大鼠大脑皮层神经元原代培养模型及缺氧模型是成功的，可用于脑缺血缺氧性疾病的体外实验的研究；（2）AdHIF-1α可显著改善缺氧后损伤神经元的超微结构，对缺氧后的神经元具有保护作用。　　第二部分Western blot法定量检测AdHIF-1α及Ad转染缺氧神经元后各组神经元中HIF-1α、EPO及VEGF蛋白的表达　　目的：探讨重组腺病毒介导的缺氧诱导因子-1α基因对大脑皮质神经元缺氧的保护作用机制，为临床治疗缺血缺氧性脑血管病提供新的治疗思路。　　方法：蛋白质印迹（Western blot）法观察正常对照（Normoxia）组、缺氧(Hypoxia)组、重组腺病毒介导的HIF-1α基因(Recombinant adenovirus-mediated hypoxia-inducible factor-1 alpha gene，AdHIF-1α）转染组及重组腺病毒空载体(Recombinant adenovirus empty vector，Ad)转染组神经元中缺氧诱导因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1 alpha，HIF-1α）、促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）及血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）蛋白的定量表达变化。　　结果：AdHIF-1α转染组HIF-1α、EPO、VEGF蛋白12h开始表达，24h表达增加，48h达高峰，72h下降，与缺氧组相比有统计学意义(P<0.01，P<0.05)，Ad组与缺氧组相比无统计学意义。　　结论：（1）正常的神经元中含有少量的HIF-1α基因，缺氧后HIF-1α基因的表达的增加；（2）外源性 HIF-1α基因促使神经元中 HIF-1α的表达增加，促使 EPO及VEGF的表达上调，对缺氧神经元有保护作用。