乳腺癌的诊断和治疗技术在过去的数十年中取得了长足的进步,但是,乳腺癌仍然是导致女性死亡率最高的癌症之一、治疗后复发率高达40％。导致癌症复发、转移的主要原因之一是肿瘤干细胞在药物治疗、放疗或手术治疗后仍有少量的残存,如乳腺癌干细胞。如何在杀伤乳腺癌细胞的同时根除乳腺癌干细胞是提高治疗效果的关键因素,也是亟待解决的重要科学问题。本研究旨在构建一种能够靶向至乳腺癌干细胞的靶向性载药脂质体,并与细胞毒药物联合应用,以达到在杀伤乳腺癌细胞的同时清除乳腺癌干细胞的目的。在构建的载药系统中,以小檗碱为模型药,以线粒体靶向性材料DQA-PEG2000-DSPE( dequalinium polyethylene glycol-distearoylphosphatidylethanolamine)、卵磷脂( egg phosphatidylcholine, EPC)、胆固醇(cholersterol, Chol)等为脂质体载体材料制备小檗碱靶向性脂质体;同时,构建了紫杉醇脂质体作为抗癌药物以与小檗碱靶向性脂质体联合应用,旨在杀伤肿瘤细胞的同时,从线粒体水平上诱导肿瘤干细胞凋亡,根除肿瘤干细胞。　　本文第一部分是文献综述,对国内外相关研究文献与进展进行了调研和评述。本部分从肿瘤干细胞的起源、肿瘤干细胞的生物学特征和鉴定方法、肿瘤干细胞的靶向治疗策略、脂质体在抗肿瘤药物纳米输送系统中的应用、小檗碱、地喹氯铵等六个方面进行文献调研。文献研究表明,以线粒体为作用靶点,以本实验室合成的具有长循环性能及线粒体靶向性材料DQA-PEG2000-DSPE修饰靶向性长循环纳米给药系统,靶向乳腺癌干细胞从线粒体水平上诱导肿瘤干细胞凋亡,可望从根本上克服肿瘤干细胞耐药及由肿瘤干细胞引起的肿瘤复发。　　本文的第二部分是关于小檗碱靶向性脂质体的制备工艺和理化性质的表征研究。本部分研究中应用本实验室合成的载体材料DQA-PEG2000-DSPE、EPC、Chol为膜材制备空白靶向性脂质体。将小檗碱包封到空白靶向脂质体中,构建了小檗碱靶向性脂质体,同时,构建了研究对照用药小檗碱脂质体、联合用药紫杉醇脂质体。考察了小檗碱脂质体、小檗碱靶向性脂质体、紫杉醇脂质体的形态、粒径、Zeta电位、包封率及体外释放情况。建立了小檗碱和紫杉醇体外HPLC含量测定方法。结果显示:(1)合成的靶向性材料DQA-PEG2000-DSPE平均分子质量为3288.8 Da;(2)建立的小檗碱体外HPLC含量测定方法在1.000μg/mL-100.0μg/mL范围内呈良好的线性关系,回收率和日内精密度、日间精密度均符合要求;(3)建立的紫杉醇体外HPLC含量测定方法在1.000-100.0μg/mL范围内呈良好线性关系,回收率和日内精密度、日间精密度均符合要求;(4)小檗碱脂质体和小檗碱靶向性脂质体的粒径均在96 nm左右,紫杉醇脂质体的粒径在80 nm左右,多分散系数均小于0.2,Zeta电位呈略电负性;(5)小檗碱脂质体、小檗碱靶向性脂质体和紫杉醇脂质体的包封率均大于90%;(6)体外释放结果表明,小檗碱、紫杉醇在最初的2 h内,释放率分别低于10%和11%,24 h后,释放率分别为35%和30%。　　在第三部分研究中,采用无血清悬浮培养法体外培养MCF-7干细胞并进行乳腺癌干细胞表型分析,考察小檗碱靶向性脂质体对MCF-7干细胞增殖抑制效果和靶向性效应。结果显示:(1)可采用无血清悬浮培养法体外筛选MCF-7乳腺癌干细胞,MCF-7乳腺癌干细胞能够在无血清培养基中以肿瘤球的形态生长和扩增;(2)肿瘤干细胞表型鉴定结果表明,细胞表面分子标志为CD44+/CD24-表型的细胞比例占98.77%,MCF-7干细胞球经含有血清的完全培养基贴壁培养72 h后, CD44+/CD24-表型的细胞比例占99.56%,肿瘤干细胞比例基本维持不变;(3)小檗碱靶向性脂质体对MCF-7细胞和MCF-7干细胞均有很强的杀伤作用,且与紫杉醇脂质体存在协同增效作用,二者联合应用可显著提高紫杉醇脂质体对MCF-7干细胞的杀伤作用;(4)与对照制剂相比,小檗碱靶向性脂质体明显增加了MCF-7干细胞对药物的摄取;(5)与对照制剂相比,小檗碱靶向性脂质体在MCF-7干细胞线粒体中有明显的共定位,能够将小檗碱集中输送至乳腺癌干细胞线粒体中。　　在第四部分研究中,考察了小檗碱靶向性脂质体抑制MCF-7乳腺癌干细胞的作用机制。通过ELISA法分别测定了乳腺癌干细胞内的五种ABC转运蛋白的表达水平变化,采用免疫组化法检测了细胞色素C从线粒体内释放到胞浆的情况,采用特异的蛋白底物显色检测细胞内凋亡酶caspase-9和caspase-3的活性以及ELISA法测定Bcl-2家族关键蛋白的表达活性。结果显示:(1)小檗碱靶向性脂质体显著降低了ABCC1和ABCG2的表达水平、略微下调了ABCC2和ABCC3的表达水平及上调了ABCB1的表达水平;(2)小檗碱靶向性脂质体选择性地在线粒体蓄积、激活了促凋亡蛋白Bax表达活性和抑制了抑凋亡蛋白Bcl-2的活性、可以引起线粒体PT孔开放,细胞色素C从线粒体释放到胞浆,活化了凋亡酶、引发caspase-9和其下游的caspase-3活性增强。该项研究证明,小檗碱靶向性脂质体能够调控乳腺癌干细胞ABC转运蛋白并能从线粒体水平诱导乳腺癌干细胞凋亡。　　第五部分研究,通过将乳腺癌干细胞异种移植到BALB/c裸鼠体内构建肿瘤复发模型,考察了小檗碱靶向性脂质体及其与紫杉醇脂质体联合给药后在裸鼠体内的抗肿瘤效果;采用活体成像技术来观察荧光染料Cy7标记的靶向性脂质体在小鼠体内的分布和肿瘤蓄积能力。研究结果表明:(1)小檗碱游离药自身约有50%的抑廇率,与小檗碱游离药或小檗碱脂质体相比,小檗碱靶向性脂质体可以更为有效的抑制MCF-7乳腺癌干细胞移植瘤的增长,肿瘤的体积抑制率在第21天可达到71.77±8.92%;与紫杉醇脂质体联合用药后,肿瘤的体积抑制率可达到85.5±9.72%;(2)与对照组制剂相比,小檗碱靶向性脂质体给药组裸鼠的体重并没有显著下降和引起血相参数变化,说明该脂质体在裸鼠体内毒性较低;(3)Cy7标记的靶向性脂质体在肿瘤组织可以观察到最强的荧光信号,活体成像结果显示, Cy7标记的靶向性脂质体在裸鼠体内24 h时在肿瘤块部位仍能观测到强烈的荧光信号。这些研究结果证明:小檗碱靶向性脂质体在动物体内可以有效地靶向到肿瘤部位,进而发挥药效有效抑制乳腺癌干细胞引起的肿瘤生长或复发。　　综上所述,本研究采用线粒体靶向性材料DQA-PEG2000-DSPE构建的小檗碱靶向性脂质体与化疗药紫杉醇脂质体联合用药,旨在杀伤乳腺癌细胞的同时根除乳腺癌干细胞。以人源MCF-7为细胞模型,采用无血清悬浮培养法获得MCF-7乳腺癌干细胞。通过细胞增殖抑制实验、流式细胞仪、激光共聚焦实验证明了小檗碱脂质体能够增加乳腺癌干细胞对小檗碱的摄取并选择性地在线粒体蓄积,通过ELISA法、免疫组化法验证小檗碱脂质体能够有效调控肿瘤干细胞表面ABC转运蛋白的表达水平,激活促凋亡蛋白Bax表达活性并抑制抑凋亡蛋白Bcl-2的活性,可以引起线粒体PT孔开放、促进大量细胞色素C从线粒体释放到胞浆、激活了凋亡酶,引发caspase-9和其下游的caspase-3级联反应。通过建立乳腺癌干细胞移植瘤模型,评价了小檗碱靶向性脂质体在动物体内的肿瘤生长抑制效应和初步毒性,以及通过活体成像实验评价了小檗碱靶向性脂质体在动物体内的分布,证明小檗碱脂质体在动物体内可以有效地靶向到肿瘤部位,进而发挥药效有效地抑制乳腺癌干细胞引起的肿瘤生长或复发。小檗碱靶向性脂质体联合应用紫杉醇脂质体能够杀伤乳腺癌细胞的同时清除乳腺癌干细胞,为治疗乳腺癌预防乳腺癌的复发提供了新治疗策略,因此,本研究具有重要的科学意义和潜在的临床应用价值。