斑马鱼早期胚胎/幼鱼急相期反应基因表达模式研究及血清淀粉样蛋白A(SAA)功能分析

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急相期反应在感染疾病的动物体内被发现,是生物体先天性免疫应答的重要组成部分,是机体受到病源微生物的感染、创伤、肿瘤增生和炎症等出现时所产生的一系列的生理反应,从而快速抵御外来微生物入侵,促进创伤的修复,维持稳定的内部环境,恢复机体正常生理功能。目前很多文献已经报道在多种动物从鱼类到哺乳动物体内都发现急相期反应的存在。在急相期反应通常伴随血清中急相期反应蛋白(APPs)浓度的升高、身体发热、血管渗透压升高以及新陈代谢和身体病理性的变化。急相期反应蛋白一般是由肝脏合成并分泌到血清中成为血浆蛋白,组成急相期反应的重要部分。在哺乳动物体内急相期反应通常是由Toll样受体介导刺激诱导前炎症因子(IL-1β和TNF-α)的产生,从而最终引起急相期反应。根据急相期反应蛋白的浓度变化可分为正急相期反应蛋白和负急相期反应蛋白。在人类体内正急相期反应蛋白有CRP、SAA、HP、C3、Bf等,白蛋白和铁传递蛋白是负急相期反应蛋白。在多种鱼类体内已经证实有和人类同源的急相期反应蛋白。近年来已经有报道证明CRP、SAA、HP、LECT2、HAMP也是成年斑马鱼体内的急相期反应蛋白。在斑马鱼或其它鱼类的早期发育的胚胎体内是否也可以启动急相期反应提供免疫保护功能的研究相对还较少。在本论文中我们研究了经LPS刺激处理的斑马鱼早期胚胎体内的急相期反应基因(CRP, SAA, LECT2, HAMP和HP)和急相期反应的诱导基因(IL-1β和TNF-α)的表达情况来判断早期胚胎体内是否能够启动急相期反应。实时荧光定量PCR的结果显示在LPS处理的斑马鱼早期胚胎中检测的这七个基因在mRNA水平上的表达量都有显著升高。胚胎原位杂交的结果显示急相期反应基因和急相期反应诱导基因在正常发育的早期胚胎体内都有母源性范表达情况,随着胚胎发育这些基因又都表现出组织特异性表达模式。LPS对胚胎的刺激可以诱导SAA在胚胎的卵黄囊和肠道的特异性表达;诱导HAMP在卵黄囊的表达;诱导LECT2在卵黄囊的表达量升高;诱导IL-1β在胚胎的卵黄囊和尾部静脉的一些血细胞中表达。这些结果说明斑马鱼胚胎可以通过启动急相期反应类提供免疫保护功能。血清淀粉样蛋白A(SAA)是斑马鱼急相期反应的重要蛋白,在细菌感染的斑马鱼体内表达量明显上升。本文中我们利用体外原核表达系统表达了SAA,在体外研究其功能,发现体外表达的重组SAA不能直接抑制细菌的繁殖但可以和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌和鳗弧菌结合,也可以和LPS和LTA结合,此外通过实验还表明重组蛋白SAA还可以促进鲤鱼的巨噬细胞对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的吞噬。这都说明SAA在斑马鱼体内可能主要发挥调理素功能。
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