[研究背景及目的]在整形外科临床工作中,骨缺损严重导致患者外观畸形、功能毁损。中国是拥有世界上最多人口的国家,每年因先天畸形、各类创伤、疾病、交通意外、肿瘤手术等造成的各类骨组织缺损的患者大概在300万例以上。随着人口老龄化范围的扩大,骨缺损患者的数量正在以每年10%的数率增长。随着组织工程的蓬勃发展和研究的不断深入,各种类型的组织工程骨开始逐渐应用于骨缺损修复,但因种子细胞功能单一、多采用异体种子细胞等,导致组织工程骨因血管化不良、排异反应等引发坏死、吸收,不仅使骨缺损修复失败,坏死物更可对机体产生不良损伤,严重阻碍了组织工程骨进入临床研究及运用。因此,构建组织相容性好,无排异反应,血管化良好的组织工程骨,是组织工程骨进行临床修复应用的关键。本课题组拟采用来源于自体的具有优异新生血管及管腔形成能力的自体外周血内皮祖细胞(EPCs)与自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)构建联合培养种子细胞,并将该种子细胞复合于课题组制备的脱蛋白生物骨构建自体组织工程生物骨,对BMSCs对EPCs的血管化促进作用、组织工程骨的成骨作用提供体外、体内连续性动态监控。为构建可血管化、无排异组织工程骨的临床应用提供系统化技术支持。[方法](1)抽取新西兰大耳白兔外周血密度梯度离心法加贴壁法提取纯化自体外周血内皮祖细胞,取第三代细胞进行免疫荧光染色检测贴壁细胞CD34、CD133vWF表面标志；(2)麻醉状态下抽取新西兰大耳白兔骨髓液,密度梯度离心法加贴壁法提取纯化自体骨髓间充质干细胞,取第三代细胞进行免疫荧光染色检测贴壁细胞CD29、CD34、CD90表面标志；(3)取骨髓间充质干细胞与外周血内皮祖细胞按照：外周血内皮祖细胞、2：1、1：2、1：1、骨髓间充质干细胞的浓度共同培养；使用倒置显微镜对各组细胞的形态变化进行观察；各组细胞的生长增殖由Wst-1法检测并描绘出曲线,比较各组细胞增殖率；(4)细胞联合培养体系构建后第3天、7天、14天时将最佳比例自体联合培养细胞(外周血EPCs及BMSCs均来源与同一实验动物)、单纯骨髓间充质干细胞、单纯内皮祖细胞进行碱性磷酸酶染色及和茜素红钙染色；倒置显微镜下观察碱性磷酸酶和骨钙素分泌情况；并采用ALP试剂盒及OC试剂盒定量测定各组细胞碱性磷酸酶和骨钙素含量：(5)于联合培养3、7、14天分别提取最佳比例自体联合培养细胞、单纯骨髓间充质干细胞、单纯内皮祖细胞组总RNA,采用实时荧光定量PCR技术检测成骨和血管化基因的表达,包括VEGF.Osteonectin.Osteopotin和Collagen Type I:(6)采用新鲜猪椎骨脱钙、脱细胞处理后制备成部分脱蛋白骨,纤维粘连蛋白包被制成脱蛋白生物骨,运用扫描电镜、液体置换法检测该生物骨的孔隙率及孔径；骨髓间充质干细胞和外周血内皮祖细胞接种部分脱蛋白生物骨片,Wst-1法检测吸光度,检测最佳比例自体联合培养细胞、单纯骨髓间充质干细胞、单纯内皮祖细胞组细胞在脱蛋白生物骨上的生长情况,确定最佳移植时间,运用扫描电镜对各个细胞组在PDPBB粘附、增殖情况进行观测；(7)抽取外周血及骨髓的健康新西兰大耳白兔12只,于其右上肢、双下肢分别进行自体工程骨回植(PDPBB+外周血内皮祖细胞组；PDPBB+骨髓间充质干细胞；PDPBB+最佳比例自体联合培养细胞组：),分别将组织工程骨植于新西兰大耳白兔股肌袋内(自体联合培养细胞组植回原取材动物体内)；硬组织切片免疫组化染色检测CD34、CD105、ZO-1分析新骨微血管化情况。[结果](1)抽取的外周血用密度梯度离心法、贴壁培养法提取纯化并进行扩增,可获得高纯度的EPCs,第三代外周血EPCs抗原CD34、CD133、vWF免疫荧光鉴定均为阳性；(2)骨髓液用密度梯度离心法、贴壁培养法提取纯化并进行细胞扩增,可获得大量高纯度的BMSCs,第三代BMSCs抗原CD29、CD90免疫荧光染色鉴定均为阳性,CD34为阴性；(3)体外联合培养细胞1：2组3天许多细胞间出现突触相互连接,自体联合培养细胞各比例组部分细胞融合成团块状,各组混合细胞Wst-1检测吸光度逐渐升高,骨髓间充质干细胞、2：1、1：2、1：1联合培养细胞体系、外周血内皮祖细胞组均在13天时达到高峰,联合培养细胞组1：2浓度吸光度最高；随后各浓度组细胞吸光度持续平台期,差异有统计学意义；(4)体外培养第3天时ALP染色：外周血内皮祖细胞组及单纯骨髓间充质干细胞组呈阴性反应,自体联合培养细胞组部分细胞阳性：7天时外周血内皮祖细胞组ALP染色仍未见阳性细胞,自体联合培养细胞组可见阳性细胞增多,有小片状细胞阳性,单纯骨髓间充质干细胞组可见散在颜色较淡的阳性细胞；14天时外周血内皮祖细胞组ALP染色仍未见阳性细胞,联合培养细胞组可见阳性细胞增多成大片状,颜色明显加深,单纯骨髓间充质干细胞组可见散在阳性细胞,颜色仍较淡；各组ALP检测量随时间延长逐渐增高,各时间自体联合培养细胞组ALP最高；外周血内皮祖细胞组碱性磷酸酶没有明显变化；ALP含量在其它各组与自体联合培养细胞之间进行两两比较均有统计学意义(P<0.01)。(5)体外培养第3天时茜素红骨钙检测自体联合培养细胞组部分细胞阳性；7天时茜素红染色外周血内皮祖细胞组仍呈阴性反应,自体联合培养细胞组可见阳性细胞增多,有小片状细胞阳性,单纯骨髓间充质干细胞组可见颜色较淡的散在阳性细胞；14天时外周血内皮祖细胞组茜素红染色仍呈阴性,联合培养细胞组可见阳性细胞细胞增多成大片状,颜色明显加深,单纯骨髓间充质干细胞组可见多量散在阳性细胞,；随时间延长,各组OC检测量逐渐增高,14天时检测量最高,OC含量在其它各组与自体联合培养细胞之间进行两两比较均有统计学意义(P<0.01)。(6)实时荧光定量PCR检测显示3天、7天、14天时自体联合培养体系VEGF、 Osteonectin、Osteopotin及Collagen Type I的mRNA表达均逐渐上升,单纯骨髓间充质干细胞组恒定表达少量Osteonectin、Osteopotin及Collagen Type I,VEGF表达量较低,单纯EPCs组VEGF表达升高。其中自体联合培养体系四种因子表达量最高。(7)电镜观察：由猪椎骨制备部分脱蛋白骨由大量的羟基磷灰石纤维编织而成,孔隙分布均匀,纤维蛋白包被的脱蛋白生物骨表面见大量颗粒状、片状纤维蛋白,自体联合培养细胞组的细胞在骨支架上粘附生长较好,并形成团块状分布,产生大量胶原蛋白丝,单纯骨髓间充质干细胞及单纯内皮祖细胞在骨支架上粘附生长较少；(8)通过Wst-1检测显示,各细胞组细胞在脱蛋白生物骨上吸光度逐渐增高,在第12天达到峰值,其中自体联合培养细胞组明显升高,各细胞组之间差异有统计学意义(P<0.01)：(9)植入新西兰大耳白兔股肌袋内的组织工程生物骨血管化情况：采用免疫组化染色检测CD105、CD34、及ZO-1的表达,结果显示第2周肉芽组织已经长入组织工程骨孔隙内,联合培养细胞组于2周、4周、8周可见阳性细胞数逐渐增多,可见薄壁的微血管形成,血管腔内可见红细胞；EPCs组见少量阳性细胞及微血管形成,单纯骨髓干细胞组阳性细胞数少,且未见明显血管管腔样结构；各时间段CD105、CD34、及ZO-1阳性表达于联合细胞组均高于单纯BMSCs组及EPCs组,差异具有统计学意义(P<0.01)；结论：(1)兔外周血经密度梯度离心分离及贴壁法提纯即可获得纯度较高的EPCs,无需特殊诱导；(2)兔骨髓液经密度梯度离心法,并结合贴壁法扩增进行分离纯化获得的BMSCs,经免疫荧光染色鉴定为较高纯度的细胞,可在联合培养实验中应用；(3)外周血内皮祖细胞和骨髓间充质干细胞体外培养下,细胞促进彼此的增殖；在体外,外周血内皮祖细胞能诱导骨髓间充质干细胞成骨分化,而骨髓间充质干细胞可促进外周血内皮祖细胞微血管化,1：2比例自体联合细胞培养可以达到最好效果；(4)体外,骨髓间充质干细胞能促进外周血内皮祖细胞血管化的能力,自体联合细胞培养体系血管化能力最强；(5)外周血EPCs可促进BMSCs在骨支架上的附着和生长,自体联合培养细胞在PDPBB支架材料上的增殖优于单纯骨髓间充质干细胞和单纯外周血内皮祖细胞,12天为最佳移植时机：(6)在动物活体内,自体联合培养细胞组微血管化能力最强,形成微血管管腔,外周血内皮祖细胞能增强组织工程骨血管化能力,形成新生血管,建立微循环,改善组织工程骨的血液供应；(7)外周血内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞联合培养体系复合PDPBB构建的组织工程骨是骨缺损修复的良好微血管化生物活性材料,具有组织相容性好,微血管化好等符合正常骨组织生理特性的优点,适合于临床实验及临床应用。