由血吸虫感染引起的血吸虫病是一种危害严重的人畜共患病。大量研究表明,寄生虫分泌的外泌体(exosomes)可以在病原体寄生过程中发挥重要的调控作用。因此,根据本课题组已有的研究结果,以日本血吸虫外泌体功能研究为基点,鉴定虫源性exosomal miRNAs所调控的宿主体内靶基因,初步探讨其对于宿主靶基因的调控作用,探索新的日本血吸虫病治疗方法;以外泌体标志性分子CD63为研究对象,寻找作为诊断血吸虫病的标志物分子。最终,为血吸虫病的诊断提供新的研究手段。本文针对日本血吸虫外泌体中miR-125b靶基因的鉴定及其功能的初步探究,及外泌体蛋白CD63的克隆表达,其血清学检测等实验展开,具体实施步骤如下:一、sjmiR-125b靶基因的鉴定及功能初步研究根据本课题组之前的研究结果,结合生物信息学分析宿主CD276可能为日本血吸虫miR-125b的一个潜在靶基因。通过荧光素酶实验验证宿主CD276为日本血吸虫miR-125b的靶基因,并分析感染血吸虫后宿主CD276基因在不同组织中的表达情况。利用PCR扩增miR-125b与CD276互作的核酸序列,并将目的片段克隆到表达荧光素酶报告基因质粒的下游。将重组质粒转染到HEK293T细胞内,检测荧光素酶报告基因表达。进一步利用qRT-PCR技术检测小鼠巨噬细胞在转染血吸虫miR-125b模拟物后,靶基因CD276的表达情况,以及小鼠巨噬细胞的增值和凋亡情况。同时检测感染血吸虫不同时间段,小鼠不同组织中CD276的表达情况。萤光素酶实验表明转染miR-125b模拟物和重组质粒后细胞的荧光素酶报告基因的表达极显著降低(P<0.01),提示miR-125b可与CD276相关区域互作,抑制报告基因的表达;血吸虫miR-125b模拟物转染小鼠巨噬细胞后导致其宿主CD276基因的表达降低,进一步提示宿主CD276可能为血吸虫mi R-125b靶基因;qPCR分析表明感染日本血吸虫后,不同感染时期,小鼠淋巴细胞、肝脏及脾脏中的CD276的表达水平极显著低于对照未感染组(P<0.01),进一步表明虫源性miR-125b可能在体内影响宿主CD276基因的表达。日本血吸虫miR-125b可能靶向调控宿主CD276的表达,在虫体调节宿主免疫系统过程中发挥重要调控功能,为探索新的治疗日本血吸虫病的方法提供理论依据。二、日本血吸虫exosomal CD63的克隆、表达及血清学分析本研究利用生物信息学分析了日本血吸虫CD63蛋白,并运用qRT-PCR分析了日本血吸虫CD63(SjCD63)在日本血吸虫不同发育时期的转录情况。应用PCR技术扩增得到编码SjCD63蛋白的部分核酸序列,并将该目的片段进行了克隆,运用原核表达方法获得重组蛋白,以重组蛋白为抗原,感染血吸虫不同天数的宿主血清为一抗做Western blot及ELISA分析。生物信息学分析表明,SjCD63存在4个跨膜结构域,两个胞外区,与曼氏血吸虫的亲缘性高;qRT-PCR结果表明该Sj CD63在血吸虫7d、14d、21d、28d等不同发育阶段均有转录,且在35d成虫阶段转录较高。Western blot及ELISA分析表明,感染血吸虫不同时间段的不同宿主,其血清中均产生了日本血吸虫CD63的抗体,且在感染初期(7d)即可有较强的抗原抗体反应。表明我们已经成功获得SjCD63重组蛋白,并且可以初步用于早期感染日本血吸虫宿主血清的检测,但是,SjCD63作为检测靶标,其对于疾病诊断的灵敏性及特异性还有待后续深入研究和验证。