背景:海藻与甘草相反,属于"十八反"反药组合之一。"十八反"历来争议颇多,有遵从古训者,亦有勇越雷池者,其能否同用,一直是中医药学界的难题之一。"十八反"多为有毒中药与无毒中药的配伍,只有海藻甘草这一反药组合,均属于无毒中药,两个无毒中药配伍产生了"相反",是配伍使用后产生还是与复方中其他药物共同作用而引起了增毒或减效的作用,目前没有明确结论。2015版《中华人民共和国药典》记载海藻为马尾藻科植物海蒿子Sargassum pallidum(Turn.)C.Ag.或羊栖菜Sargassum fusiforme(Harv.)Setch.的干燥藻体。前者习称"大叶海藻",后者习称"小叶海藻"。关于不同品种海藻与甘草配伍后比较的研究不多,且主要集中在关于海蒿子和羊栖菜与甘草单独配伍的研究,关于两种不同品种的海藻与甘草配伍后对于反药组合药效或毒性的影响,目前没有结论。因此,本实验在课题组已完成的实验研究基础上,选择有临床应用基础的经典名方海藻玉壶汤,针对病理条件下,不同品种海藻与甘草加减配伍进行研究,从而挖掘基于临床应用的不同品种海藻与甘草配伍对甲状腺肿大模型大鼠的毒效作用及其内在机制,以期为完善中药配伍禁忌理论和指导临床"相反"药物配伍应用提供实验依据。目的:基于甲状腺肿大模型,探讨含不同品种海藻的海藻玉壶汤在海藻甘草加减配伍条件下的毒效作用,验证是否与方中的反药组合相关。通过下丘脑-垂体-甲状腺轴及甲状腺相关基因表达,探讨不同品种海藻与甘草加减配伍应用治疗甲状腺肿大的机制;通过CYP450相关基因及蛋白表达以及肾脏凋亡等相关指标探讨不同品种海藻对甲状肿大大鼠肝肾功能影响的机制。方法:1.急性毒性实验:比较海蒿子、羊栖菜,二者与生甘草配伍使用,及其在海藻玉壶汤中加减配伍对小鼠急性毒性的影响,以评价单味药、二者分别与甘草配伍以及含不同品种海藻的海藻玉壶汤的急性毒性。2.生物效应:在前期实验研究中,我们已经探讨了含不同品种海藻的海藻玉壶汤在海藻甘草接近临床剂量的条件下的毒-效关系。海藻甘草剂量为《药典》高限剂量的两倍时对甲状腺肿大的治疗效果明显,因此选择该剂量进行本实验研究,去掉海藻玉壶汤反药组合中的一味或两味,观察其对模型大鼠的药效影响及毒理作用。将大鼠随机分为空白组、模型组、阳性药(左甲状腺素钠片)组、海藻玉壶汤海蒿子配生甘草组(以下简称全方海组)、海藻玉壶汤羊栖菜配生甘草组(以下简称全方羊组)、海藻玉壶汤海蒿子去甘草组(以下简称海去草组)、海藻玉壶汤羊栖菜去甘草组(以下简称羊去草组)、海藻玉壶汤去海藻组(以下简称去海藻组)、海藻玉壶汤去海藻甘草组(以下简称去藻草组)。检测甲状腺功能相关指标、血液生化相关指标及心肝肾病理组织形态方面的变化,观察其毒效作用,验证其生物效应是否与方中的反药组合相关。3.机制研究:检测"效"的机制相关指标:检测血清中甲状腺激素代谢相关指标水平,包括:促甲状腺激素释放激素、甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、蛋白水解酶、促甲状腺激素;甲状腺激素受体水平:促甲状腺激素受体、促甲状腺激素受体抗体;RT-PCR法检测甲状腺中Tg及TPO基因表达。肝肾影响的机制相关研究:肝脏代谢:肝组织CYP450基因及蛋白表达。肾脏相关机制:尿乳酸脱氢酶、尿表皮生长因子、尿β2-微球蛋白;TUNEL法检测肾组织凋亡细胞。结果:1.急性毒性实验结果:各组别药物对小鼠急性毒性依次表现为:海蒿子组>海蒿子生甘草组>海去草组>全方海组>去藻草组>羊去草组;其余各组未表现出毒性。海蒿子与羊栖菜在单用、与生甘草配伍应用以及在海藻玉壶汤复方中加减配伍应用的急性毒性实验中,均表现出明显的差异,单用及各配伍组合中,海蒿子毒性高于羊栖菜。2.含反药组合的海藻玉壶汤中海藻不同品种与甘草加减应用对甲状腺肿大大鼠生物效应的影响(1)药效作用:与空白组相比,模型组大鼠体重明显减轻,体温下降,甲状腺系数升高,血清T4、FT4水平降低和TSH、TRH升高,病理切片显示甲状腺组织小叶排列紊乱,甲状腺滤泡内分泌物明显减少,滤泡上皮细胞弥漫性增生和肥大,提示甲状腺肿大模型建立成功。阳性药明显改善甲肿大鼠的体重减轻、回调血清甲状腺激素水平,但在调节升高的血清TRH、TSI水平方面,即对下丘脑-垂体-甲状腺轴的影响未见明显作用。全方海组、全方羊组在回调甲肿大鼠体温、甲状腺系数及组织形态学改善方面,效果明显优于阳性药及拆方各组,且对回调升高的TSH、TSHR有明显效果,与下丘脑-垂体-甲状腺轴的作用有关。(2)毒性表征1)肝脏:根据肝脏系数、肝脏内酶水平、肝脏合成功能以及肝脏组织形态学的变化,评价不同品种海藻与生甘草反药组合加减配伍应用对甲状腺肿大模型大鼠肝功能的影响。结果显示,丙硫氧嘧啶所致甲状腺肿大大鼠显示出了一定程度的肝损伤,在这一病理状态下,海藻玉壶汤中不同品种海藻与甘草配伍加减各组,对相应的指标有回调作用;海藻甘草反药组合在海藻玉壶汤中应用,对甲状腺肿大模型大鼠的肝损伤有恢复作用,优于相应的去海藻或甘草组;其中,全方海组、海去草组表现出明显的恢复作用。而全方羊组表现出了影响肝脏中白蛋白的合成的结果。海蒿子与羊栖菜分别于复方海藻玉壶汤中配伍,二者显示出了对肝功能影响的差异。2)肾脏:根据肾脏系数、肾功能相关指标、血尿电解质以及肾脏组织形态学的变化,评价不同品种海藻与生甘草反药组合加减配伍应用对甲状腺肿大模型大鼠肾功能的影响。结果显示,丙硫氧嘧啶所致甲状腺肿大大鼠表现出了一定程度的肾损伤,血清电解质水平受到影响,在这一病理状态下,全方海组、海去草组对相应的指标有明显的恢复作用。而全方羊组对肾功能表现出一定的影响。3)心脏:根据心脏系数、肌酸激酶、乳酸脱氢酶水平以及心脏组织形态学的变化,评价不同品种海藻与生甘草反药组合加减配伍应用对甲状腺肿大模型大鼠心功能的影响。结果显示,模型组大鼠未见明显心功能损伤。海藻甘草反药组合于复方中应用,与去藻草组相比,对于心肌酶的调节显示出了一定的作用。4)血液系统:根据全血细胞分析,评价不同品种海藻与生甘草反药组合加减配伍应用对甲状腺肿大模型大鼠血液系统的影响。结果显示,丙硫氧嘧啶所致甲状腺肿大大鼠,红细胞系统受到抑制,血小板水平明显升高,嗜酸性粒细胞百分比降低。在这一病理状态下,全方海组、全方羊组对甲状腺肿大大鼠的红细胞系统有一定的恢复作用,且能调节升高的血小板和降低的嗜酸性粒细胞百分比,优于相应的各拆方组合,二者之间未见明显差异。5)脂质过氧化:结果显示,丙硫氧嘧啶所致甲状腺肿大大鼠氧化和抗氧化作用未见失衡。海藻甘草反药组合于复方中应用,会引起大鼠自由基水平下降,同时自由基清除也减少,因此对于甲状腺肿大大鼠氧化和抗氧化能力无明显影响。3.机制探讨(1)药效机制探讨:模型组大鼠甲状腺组织TPO、TgmRNA表达明显增强。全方海组、全方羊组能抑制TPO基因表达的增强。(2)肝脏影响机制探讨:模型组大鼠肝脏CYP2E1/3A1/3A2mRNA表达增强,海藻玉壶汤中不同品种海藻与甘草配伍加减各组,对相应的指标有回调作用;海藻甘草反药组合在海藻玉壶汤中加减应用,对甲状腺肿大模型大鼠的肝损伤有恢复作用;其中,全方海组、海去草组显示出明显的恢复作用。推测可能与海藻玉壶汤(海蒿子/羊栖菜)对增强的基因表达有回调作用有关,可以抑制肝脏内的前毒物,抑制药物吸收,发挥保护肝功能的作用。而全方羊组表现出了影响肝脏中白蛋白的合成的结果。海蒿子与羊栖菜分别于复方海藻玉壶汤中配伍,二者显示出了对肝功能影响的差异。而海藻玉壶汤(海蒿子/羊栖菜)对CYP2E1蛋白表达未见明显影响。(3)肾脏影响机制探讨:模型组大鼠出现肾小管损害及细胞凋亡,但重吸收功能未见影响。在这一病理状态下,全方海组、全方羊组、海去草组对肾小管损害有保护作用,其效果优于各拆方组,但对肾组织细胞凋亡无明显影响。结论:1.海藻甘草反药组合在海藻玉壶汤中应用,对甲状腺肿大的恢复作用及回调甲状腺激素水平的效果优于各拆方组,与下丘脑-垂体-甲状腺轴的调节作用有关。不同品种的海藻与甘草配伍,未显示出明显差异。2.海藻甘草反药组合在复方中加减应用,对甲状腺肿大模型大鼠的肝肾损伤有恢复作用,且能恢复受抑制的红细胞系统;其中,全方海组、海去草组显示出较明显的恢复作用。而全方羊组表现出了影响肝脏中白蛋白的合成、影响肾功能相关指标的结果。不同品种海藻与甘草配伍,分别于海藻玉壶汤中应用,二者显示出了对肝肾功能影响的差异。3.全方海组对CYP2E1/3A1/3A2基因表达的增强有回调作用,可以抑制肝脏内的前毒物,抑制药物吸收,发挥保护肝功能的作用。全方海组、全方羊组、海去草组对肾小管损害有保护作用,其效果优于各拆方组,但对肾组织细胞凋亡无明显影响。