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目的:本研究构建巨噬细胞移动抑制因子(MIF) siRNA,并探讨其对脂多糖/流感病毒介导的急性肺损伤的炎症反应和免疫反应的影响,及相关信号转导机制的作用,探索急性肺损伤治疗的新模式。研究内容和方法:第一部分:MIF siRNA在人肺泡上皮细胞A549的转染和干扰目的基因MIF表达将MIF siRNA用转染剂INTERFERin介导转染体外培养的A549细胞,通过RT- PCR方法观察不同浓度MIF siRNA转染后,对MIF mRNA表达的影响;采用细胞免疫荧光方法分析MIF蛋白表达的强弱;应用MTT方法测定MIF siRNA转染对细胞的毒性,及对LPS刺激A549细胞生存率的影响。第二部分:MIFsiRNA对脂多糖刺激/流感病毒感染人肺泡上皮细胞Toll样受体及其下游信号转导通路的影响离体研究:运用RT-PCR、Western-Blot、细胞免疫荧光和ELISA方法,分别从mRNA、蛋白、介质水平三个层面检测了LPS刺激/流感病毒感染人肺泡上皮细胞A549后TLR2、TLR3、TLR4的mRNA表达;下游MyD88依赖/非依赖信号转导通路元件MyD88和IRF3蛋白表达;核因子NF-κB的核迁移;细胞培养上清炎症介质TNF-α、IL-1β、IL-6,免疫介质IFN-β分泌水平;以及MIF siRNA对其表达的影响。第三部分:MIF siRNA对脂多糖/流感病毒介导的小鼠急性肺损伤的保护作用及相关的信号转导机制动物研究:建立LPS/流感病毒(H1N1)介导的急性肺损伤小鼠模型,运用EMSA、Western-Blot、免疫组化、ELISA和相关病理技术,观察LPS/H1N1介导的急性肺损伤炎症介质TNF-α、IL-1β、IL-6释放的情况,肺组织炎症病理变化,肺组织水通道蛋白AQP1、AQP4表达与肺部感染、水肿关系,以及NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)2条信号转导通路中NF-κB、IκB-α、p-p38/p38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK表达;同时探讨MIF siRNA对脂多糖/流感病毒介导的小鼠急性肺损伤的保护作用及相关的信号转导机制。结果:第一部分:MIF siRNA在人肺泡上皮细胞A549的转染和干扰目的基因MIF表达1. MIF siRNA转染体外培养的A549细胞后,可以明显降低MIF mRNA的表达;且不同浓度(0nM、10nM、50nM、100nM)MIF siRNA对细胞进行转染,只有当MIF siRNA浓度大于50nM时,才能明显降低MIF mRNA的表达。2. MIF siRNA转染后,A549细胞MIF的绿色荧光蛋白表达也明显降低,在此基础上,再加入MIF刺激,MIF的蛋白表达又明显增加。3.转染50nM MIF siRNA后,对A549细胞几乎没有毒性;且对LPS刺激A549细胞导致细胞死亡及细胞的生存率下降有一定的保护作用。第二部分:MIF siRNA对脂多糖刺激/流感病毒感染人肺泡上皮细胞Toll样受体及其下游信号转导通路的影响1.1 LPS刺激A549细胞6h时,细胞因子MIF、TLR2、TLR4 mRNA的表达显著增加,分别加入MIF siRNA+DXM、MIF siRNA和DXM的3组干预组,均可下调MIF、TLR2、TLR4 mRNA的表达;而LPS刺激对TLR3 mRNA表达无影响。1.2 H1N1感染A549细胞16h时,细胞因子MIF、TLR3 mRNA的表达显著增加;分别加入MIF siRNA+RBVR、MIF siRNA、RBVR、MIF siRNA+DXM、DXM的5组干预组,均可下调MIF、TLR3 mRNA的表达;而H1N1感染对TLR2、TLR4 mRNA表达无影响。其中MIF siRNA+DXM干预组有协同下调LPS刺激/H1N1感染引起的MIF mRNA高表达的作用。2.1 LPS刺激A549细胞6h时,MyD88和IRF3蛋白表达显著增加;分别加入MIF siRNA+DXM、MIF siRNA和DXM的3组干预组,对MyD88表达均有下调作用,而仅MIF siRNA+ DXM和DXM干预组对IRF3表达有抑制作用,单纯MIF siRNA对IRF3表达无影响。2.2 H1N1感染A549细胞16h时,MyD88和IRF3蛋白表达显著增加;分别加入MIF siRNA+RBVR、MIF siRNA、RBVR、MIF siRNA+DXM、DXM的5组干预组,对MyD88表达均有下调作用,同样仅MIF siRNA+ DXM和DXM干预组对IRF3表达有抑制作用,其余的3组干预组对IRF3表达无影响。3.LPS刺激8h时/或H1N1感染24h时,MyD88在A549细胞的绿色荧光蛋白的表达增多和增强,加入MIF siRNA干预,可下调MyD88蛋白的表达;LPS刺激45min时/或H1N1感染6h时,NF-κB在A549细胞发生核迁移,加入MIF siRNA干预,可部分阻断NF-κB核迁移。4.1 LPS刺激6h时,细胞培养上清TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-β分泌水平显著增加;分别加入MIF siRNA+DXM、MIF siRNA和DXM的3组干预组,均可以不同程度降低炎症介质TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平。4.2 H1N1感染24h时,细胞培养上清TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-β分泌水平显著增加;分别加入MIF siRNA+RBVR、MIF siRNA、RBVR、MIF siRNA+DXM、DXM的5组干预组,均可以不同程度降低炎症介质TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平。其中仅MIF siRNA+DXM和DXM2组干预组对LPS刺激/H1N1感染引起的IFN-β高分泌水平有抑制作用。第三部分:MIF siRNA对脂多糖/流感病毒介导的小鼠急性肺损伤的保护作用及相关的信号转导机制1.LPS刺激2h时,或H1N1感染24h时,均可引起小鼠肺组织NF-κB在细胞核的表达增加,IκB-α在细胞浆的表达下降;LPS刺激时加入MIF siRNA、DXM和MIF siRNA +DXM的3组治疗组, H1N1感染时加入MIF siRNA、RBVR、MIF siRNA+RBVR、DXM和MIF siRNA+DXM的5组治疗组,均可不同程度下调NF-κB表达和上调IκB-α表达,其中MIF siRNA+DXM治疗组对IκB-α的上调作用最大。2.1 LPS刺激2h时,磷酸化的p-p38、p-ERK、p-JNK蛋白表达显著增加,对非磷酸化的p38、ERK、JNK蛋白表达无影响;在LPS刺激下,分别加入MIF siRNA、DXM和MIF siRNA+DXM的3组治疗组,均可以不同程度下调p-p38和p-JNK的表达,但3组治疗组均对p-ERK表达无影响。2.2 H1N1感染24h时,仅磷酸化的p-ERK蛋白表达显著增加;在H1N1感染下,分别加入MIF siRNA、RBVR、MIF siRNA+RBVR、DXM和MIF siRNA+DXM的5组治疗组,也只有RBVR和MIF siRNA+RBVR的2组治疗组,可下调p-ERK的表达。3.LPS刺激,或H1N1感染,小鼠肺脏湿重增加,显微镜下可见肺泡正常结构破坏,间质增厚,炎性细胞浸润,上皮细胞和血管内皮细胞的肿胀脱落;LPS刺激时加入MIF siRNA、DXM和MIF siRNA +DXM的3组治疗组,H1N1感染时加入MIF siRNA、RBVR、MIF siRNA+RBVR、DXM和MIF siRNA+DXM的5组治疗组,均能减轻小鼠肺部病理损伤和降低肺组织湿干重比。4.与正常组比较,LPS刺激组和H1N1感染组肺组织血管微血管内皮、支气管周围血管床、气管粘膜上皮(AQP1)及肺组织大小气管上皮和肺泡(AQP4)可见明显减少的棕黄色阳染;经上述治疗组治疗后,AQP1和AQP4的表达有所增强。5.在LPS刺激,或H1N1感染,小鼠肺匀浆的炎症介质TNF-α、IL-1β、IL-6分泌水平均显著增加;经上述治疗组治疗后,均可以不同程度降低炎症介质TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平。结论:1.线性阳离子聚合物jetPEI能成功转运MIF siRNA到达目的细胞,MIF siRNA能在A549细胞特异沉默目的基因MIF mRNA和蛋白的表达,且对LPS刺激导致细胞死亡有一定的保护作用。2.首次证实MIF siRNA均能阻断LPS刺激A549细胞诱导的TLR4或H1N1感染A549细胞诱导的TLR3高表达,阻断下游信号转导通路元件MyD88,抑制炎症介质TNF-α、IL-1β、IL-6过度分泌。MIF siRNA和地塞米松(DXM)对下游信号转导通路的影响存在差异,DXM均可阻断MyD88和IRF3的合成,既抑制炎症反应又抑制免疫反应;而MIF siRNA仅阻断MyD88合成,对IRF3表达无影响。3.在LPS/H1N1介导的小鼠急性肺损伤实验中,MIF siRNA对LPS/H1N1诱导激活的NF-κB有明显抑制作用,在MAPK信号转导通路,首次证实MIF siRNA对LPS诱导的p-p38和p-JNK高表达有下调作用,从而抑制炎症介质TNF-α、IL-1β、IL-6释放,减轻小鼠肺组织病理损伤。MIF siRNA能减轻脂多糖或流感病毒介导的急性肺损伤,可能是其特异沉默目的基因MIF,遏制肺损伤的多种信号转导通路的激活,抑制炎症反应。