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目的: 利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术抑制髓母细胞瘤细胞中Metadherin(MTDH)基因的表达水平,来观察和分析该基因对人髓母细胞瘤Daoy细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenehymal transition,EMT)的影响,初步探讨MTDH基因在髓母细胞瘤转移中的作用。 方法: 首先设计、合成MTDH基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列(MTDH siRNA)和阴性对照siRNA序列,进而构建相应的表达质粒,在E.coli菌株中进行扩增培养,分别提纯质粒。将本实验室购买的髓母细胞瘤细胞株Daoy细胞培养于含10%FBS的DMEM培养基中,当细胞增殖到一定数量,将细胞消化后接种于6孔板,每孔含5×105个细胞,过夜培养。实验共分为三组:MTDH siRNA组、阴性对照siRNA组和普通Daoy细胞组。待生长至30%-50%密度,MTDH siRNA组、阴性对照siRNA组细胞分别取MTDH siRNA质粒和阴性对照siRNA质粒与Lipofectamine2000试剂进行转染;普通Daoy细胞组仅加转染试剂Lipofctamine2000。随后观察细胞的生长状况,绘制细胞生长曲线来评价 MTDH对肿瘤细胞增殖、生长特性的影响,并用TUNEL染色荧光显微镜下观察肿瘤细胞的凋亡情况。采用细胞划痕实验检测MTDH干扰后对肿瘤细胞侵袭能力的影响。分别收集三组细胞,提取总RNA和蛋白质,通过RT-PCR检测MTDH目的基因水平,以及细胞中上皮细胞标记基因和间质细胞标记基因水平的变化,包括E-Cadherin(CDH1)、vimentin(VIM)等;通过Western-Blot法检测MTDH蛋白、CDH1蛋白、VIM蛋白的表达水平。 结果: 成功设计合成髓母细胞瘤株Daoy细胞MTDH的小干扰RNA(MTDH siRNA)序列,并构建相应的表达质粒。RT-PCR实验结果显示,与阴性对照siRNA细胞组和普通Daoy细胞组相比,MTDH siRNA组细胞MTDH mRNA的表达和VIM mRNA表达显著减少(P<0.05),CDH1 mRNA表达增高(P<0.05)。Western blot印迹实验表明,MTDH siRNA组与阴性对照siRNA组和普通Daoy细胞组比较,细胞中MTDH蛋白和VIM蛋白印的印迹减弱,CDH1蛋白印迹升高。MTDH siRNA质粒组与阴性对照siRNA组和普通Daoy细胞组相比,细胞生长增殖受到一定程度的抑制,细胞划痕实验阳性,证明干扰MTDH mRNA的表达后可抑制髓母细胞瘤的生长,迁移,有效促进其凋亡。阴性对照siRNA组和普通Daoy细胞组间MTDH、VIM、CDH1蛋白的表达均无显著差异(P>0.05),细胞生长增殖没有受到影响,细胞划痕实验阴性,肿瘤细胞的转移运动能力未受到影响。 结论: MTDH siRNA质粒和阴性对照siRNA质粒成功转染入人髓母细胞瘤Daoy细胞株,并有效的抑制了MTDH基因的表达。 沉默MTDH基因后髓母细胞瘤Daoy细胞株中CDH1表达升高,VIM蛋白表达亦降低,有效的抑制了细胞的上皮间质转化(EMT)过程。 MTDH基因的高表达可能是肿瘤发生侵袭转移的重要分子标志。RNA干扰方法有望成为解决髓母细胞瘤抗浸润转移治疗的新途径之一。