苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)是一种革兰氏阳性菌,主要特征是在形成芽胞的过程中伴有杀虫晶体蛋白组成的伴胞晶体的形成。大多数苏云金芽胞杆菌的伴胞晶体在母细胞一侧形成,当芽胞成熟母细胞裂解后,晶体和芽胞处于游离的状态。而少数亚种(如幕虫亚种)形成的伴胞晶体定位于芽胞外壁和芽胞衣之间,当母细胞裂解后伴胞晶体和芽胞不会分离,这种特殊的表型被称为晶胞粘连(Spore-Crystal Association,简称SCA)。晶胞粘连表型在半个世纪前就已经被鉴定出来,而对于其形成机制,至今还没有报道。本研究以具有典型晶胞粘连表型的苏云金芽胞杆菌幕虫亚种YBT-020为出发菌株开展了相关实验,结果如下：1.采用Solexa测序技术测定了YBT-020的全基因组序列,并进行了初步分析。结果表明YBT-020的基因组由1条染色体和2个质粒构成,其中染色体的长度为5,355,490个碱基对(bp),共编码5,477个开放阅读框(ORF)；质粒pBMB26大小为187,880 bp,质粒pBMB28大小为139,013 bp,分别编码200和149个ORFs。2.通过接合转移实验确定控制晶胞粘连的基因位于质粒pBMB26和pBMB28上。通过构建菌株YBT-020的基因组细菌人工染色体文库,从中筛选到6个克隆子重叠覆盖完整的pBMB26序列,4个克隆子重叠覆盖完整的pBMB28序列。利用片段互补实验将控制晶胞粘连的基因定位在pBMB26和pBMB28的两个35kb的片段上,通过缺失实验获得控制晶胞粘连最小的区域。质粒pBMB26上最小区域仅编码晶体蛋白基因cry26Aa;质粒pBMB28上最小区域编码5个基因,分别命名为orfl-orf5,序列比对表明orfl和orf2为晶体蛋白类似基因,orf3,orf4和orf5为芽胞萌发受体类似基因。这6个基因可以在异源宿主BMB171中呈现晶胞粘连表型。3.通过基因敲除和互补实验验证了异源表达获得的6个控制晶胞粘连的基因在菌株YBT-020中的作用,菌株BMBJ1为晶体蛋白基因cry26Aa敲除突变株,镜检发现晶胞粘连表型丢失,互补基因cry26Aa后晶胞粘连表型恢复,说明cry26Aa所编码的晶体蛋白对晶胞粘连是必需的,也同时暗示该蛋白是伴胞晶体的主要成分；菌株BMBJB为orfl和orf2同时敲除突变株,镜检发现在母细胞裂解后晶胞粘连表型丢失,互补这两个基因后晶胞粘连表型恢复,透射电镜表明敲除这两个基因后伴胞晶体形成在芽胞外壁的外侧,互补这两个基因后伴胞晶体产生在芽胞外壁和芽胞衣之间。分别将两个基因移码突变后互补,都不能恢复晶胞粘连表型,说明orfI和orf2在伴胞晶体的定位中起到关键的作用；菌株BMBJB为orf3,orf4和orf5同时敲除的突变株,镜检观察显示母细胞裂解后仍存在晶胞粘连表型,但这种表型没有野生株YBT-020稳定,当连续培养100 h后,基本观察不到晶胞粘连表型存在,互补这三个基因后,稳定的晶胞粘连表型恢复,说明orf3,orf4和orf5在晶胞粘连表型稳定中起到重要作用。4.质粒pBMB26序列比对分析发现该质粒没有复制蛋白相似性的基因,仅发现orf69编码ATP依赖的DNA解螺旋酶,orf71编码DNA聚合酶Ⅲ的亚基,这两个基因报道和质粒复制有关。为了证明该区域有复制功能,将12 kb包含这两个基因的EcoRI片段克隆到复制子克隆载体pHT304E上转化无质粒突变株4Q7,实验结果显示该片段具有复制功能。缺失实验和移码突变实验证实最小复制区包含两个基因：orf69和orf70。orf70编码一个未知功能蛋白,预测这个蛋白可能是一类新型的复制蛋白,原因包括复制起始位点(ORI)位于orf70的内部,且该基因编码的蛋白包含一个HTH结构域；orf69编码一个与PcrA解螺旋酶的7个保守结构域有很高同源性的蛋白,命名为PcrA26。为了证明ORF70蛋白是一个新型的复制蛋白,在大肠杆菌中表达纯化了ORF70蛋白；琼脂糖凝胶阻滞实验证明ORF70蛋白与ORI位点存在蛋白质和DNA的相互作用,故将ORF70命名为Rep26。实验结果表明克隆得到的pBMB26复制子是一种新型的复制子。5.序列比对发现pBMB28的ORF32与已报道的复制蛋白Ori44氨基酸序列一致性为93%,由此推测ORF32与其侧翼序列构成p28的复制区。将含有ORF32的4.1kb的EcoRI片段克隆到复制子克隆载体pHT304E上转化无质粒突变株4Q7。实验证明该片段具有复制功能。进一步通过缺失实验,将质粒pBMB28的复制子缩短到一个3kb的片段上,其复制稳定性为71%。序列比对发现BAC克隆子pBAC721可能包含了pBMB28的接合转移区,通过双亲本杂交实验证明pBAC721具有自主接合转移能力,克隆到了pBMB28的接合转移区。