论文部分内容阅读
目的观察大鼠癫痫持续状态(status epilepticus, SE)后海马区脑组织miR-34a的表达分布规律；通过干预miR-34a表达水平,探讨其在癫痫后海马神经元凋亡中的作用。方法1.建立模型：采用6-8周龄健康雄性SD大鼠,随机分为空白对照组(Normal, N组),癫痫组(Epilepsy, Ep组),干预组(Antagomir,A组)和干预对照组(Antagomir-control,C组)。对EP组、A组、C组建立氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠SE模型。在SE诱导成功后4-6小时分别对A组和C组侧脑室立体定向给予Antagomir和Antagomir-control干预miR-34a表达水平,各组均以在1天(24小时,急性期)、7天(静止期)作为研究时间点。2.对大鼠行脑电图检查,记录生理状态、致痫期Ⅳ级以上发作状态、造模成功后发作间期状态、自发发作状态的脑电变化,确认癫痫模型的建立。3.实时定量-PCR检测各组miR-34a表达水平,检测干预前后miR-34a表达量的变化,以验证药物干预miR-34a的效果。4.采用Western Blot和免疫组化技术检测caspase-3蛋白在大鼠海马组织中的分部及其表达量的变化。5. TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling)法检测大鼠SE后海马区脑组织神经元细胞凋亡情况。6. Nissl染色研究大鼠SE后海马区脑组织神经元细胞缺失及存留情况。结果1.依据动物行为学表现及脑电图结果,最终造模组(Ep组、A组、C组)大鼠成模率为89.17%。成模及干预后,大鼠因自身恢复、麻醉意外、手术创伤等因素,部分发生死亡,最终可用实验组动物的成活率为69.17%。2.实时定量PCR检测显示,在急性期和静止期,miR-34a的表达在Ep组较N组均显著增高,药物干预后A组较C组均显著降低,有显著性差异,干预有效。3. Western Blot检测显示,在急性期和静止期,caspase-3蛋白的表达在Ep组较N组均显著增高,药物干预后A组较C组均显著降低,有显著性差异,与实时定量PCR结果趋势相一致。4.免疫组化检测显示,在急性期和静止期,Ep组与药物干预对照C组中caspase-3蛋白在海马(CA1、CA3区)神经元胞浆均高表达,而N组和药物干预A组均仅有较低密度的表达,与Western Blot结果相一致。5. TUNEL检测显示,在急性期和静止期,Ep组海马(CA1、CA3区)神经元细胞凋亡均明显多于N组；药物干预后A组海马(CA1、CA3区)神经元细胞凋亡均明显低于C组,与实时定量PCR、Western Blot、免疫组化结果相一致。6. Nissl染色显示,在急性期和静止期,Ep组海马(CA1、CA3区)神经元细胞损失均明显多于N组,存留的神经元细胞均明显少于N组；药物干预后A组海马(CA1、CA3区)神经元细胞损失均明显少于C组,存留的神经元细胞均明显多于N组,与实时定量PCR、Western Blot、免疫组化、TUNEL结果相适应。结论大鼠癫痫持续状态后的急性期和静止期,海马(CA1、CA3区)神经元中miRNA-34a可通过上调caspase-3蛋白的表达,激活下游凋亡通路,造成海马区神经元细胞凋亡。