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第一部分:miR-29s家族在肝细胞癌中的表达及临床意义研究研究背景和目的肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一,全世界范围的发病率居于恶性肿瘤的第五位,死亡率居第三位。肝癌在早期难以发现和诊断且预后极差,因此,寻找可靠、有效的分子标志物来预测肝癌患者的预后对改善肝癌患者的不良预后具有重要的意义。MiRNAs是一种小分子非编码RNA,具有调控基因表达的功能,越来越多的研究发现除了参与细胞生物学过程外,miRNAs还可以作为肿瘤生物标志物来判断肿瘤患者的预后。MiR-29s家族主要包括miR-29a、miR-29b和miR-29c三种miRNAs,很多研究发现miR-29s家族与多种癌症密切相关,但miR-29s家族是否能作为标志物来判断肝癌患者的预后还不明确,因此,本研究旨在检测miR-29s家族在肝癌组织中的表达和评估其在临床上作为肝癌预后判断标志物的有效性。研究方法①研究对象:选取2008年到2015年在内蒙古自治区人民医院实行肝切除术的122例肝细胞癌患者为研究对象:经病史询问和全身体格检查后,采集患者的静脉血进行肝功能检测和肿瘤标志物检测;CT和MRI检查评估患者TNM分期;进行肝切除术,记录肿瘤直径、位置以及剩余肝脏大小,肝切除术遵循Couinaud肝段划分法。②手术标本保存:手术后立即将肝癌组织及癌旁组织置于液氮中,随后转移到-80℃冰箱中储存或者制成石蜡组织标本。③组织RNA提取和miRNA定量检测:组织RNA提取采用酚-氯仿法;采用miRNA试剂盒扩增miRNA并在ABI 7300系统上进行定量检测。④随访:随访过程中每个月检测血清甲胎蛋白(AFP)水平以及腹部B超检查,术后2年内每3个月进行腹部CT和MRI检查,2年后每6个月进行腹部CT和MRI检查。生存时间定义为术后到死亡或者最后一次随访之间的时间。⑤对miRNA的检测结果以及其他临床病理特征进行COX比例风险分析来探讨影响肝癌患者预后的相关因素。研究结果①研究对象的中位随访时间为6.5年(6.2月～8.2年),122例肝癌患者中,男女比例为2.49:1,肿瘤直径≤5cm的比例为63.1%,微血管浸润的比例为62.3%,单发肿瘤的比例为81.1%,miR-29a、miR-29b和miR-29c低表达的比例分别为 42.6%、78.7%和 35.3%。②与癌旁组织相比,肝癌组织中miR-29a、miR-29b和miR-29c表达均降低(P<0.001)。⑤122例肝癌患者1年、3年和5年总生存率分别为87.5%、53.3%和44.1%,生存统计和Kaplan-Meier曲线表明AFP>400ng/ml(P=0.004)、肿瘤直径>5cm(P=0.002)、微血管浸润(P=0.011)、多发性肿瘤(P=0.007)、miR-29b和miR-29c的共同低表达(P=0.012)与患者预后有关,miR-29a与预后无明显相关。④AFP>400ng/ml与5年总生存率从53.4%下降到28.6%有关(P=0.010);肿瘤直径>5cm与5年总生存率从53.1%下降到28.6%有关(P<0.001);微血管浸润与5年总生存率从57.1%到34.4%有关(P=0.009);多发肿瘤与5年总生存率从48.7%下降到24.8%有关(P=0.036);miR-29b的低表达与5年总生存率从70.2%下降到39.1%有关(P=0.020);miR-29c的低表达与5年总生存率从53.6%下降到23.7%有关(P=0.012);miR-29b与miR-29c的共同低表达与5年总生存率从51.7%下降到30.5%有关(P=0.006)。⑤COX比例风险分析也显示AFP>400ng/ml、肿瘤直径>5cm、微血管浸润、多发性肿瘤以及miR-29b与miR-29c的共同低表达与肝癌患者预后不良有关;miR-29b与miR-29c的共同低表达是肝癌患者预后判断的独立预测因素(HR=2.561,P=0.012)。研究结论①MiR-29a、miR-29b和miR-29c在肝癌组织中表达降低。②AFP>400ng/ml、肿瘤直径>5cm、微血管浸润、多发性肿瘤以及miR-29b与miR-29c的共同低表达与肝癌患者生存率降低有关,且miR-29b与miR-29c的共同低表达是肝癌患者预后的独立预测因素。第二部分:miR-29s家族对肝癌细胞增殖凋亡的实验研究研究背景和目的肝癌的发病机制尚不清楚,原发性肝癌的分子机制研究是目前的研究热点。在第一部分研究中已经发现miR-29s家族中miR-29b与miR-29c的共同低表达是肝癌患者预后的独立预测因素,但miR-29s家族对肝癌细胞的增殖生长和凋亡的作用及机制还不明确,因此,本研究旨在探讨miR-29s家族对肝癌细胞增殖凋亡的影响。研究方法①体外培养人正常肝细胞株L02和人肝细胞癌细胞株SMMC-7721,用RT-qPCR法检测miR-29a、miR-29b和miR-29c在正常肝细胞以及肝癌细胞中的表达。②在SMMC-7721细胞中分别转染miR-29a、miR-29b和miR-29c mimics来提高三个miRNAs在肝癌细胞中的表达,用MTS法检测细胞增殖活力;采用平板克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力;采用流式细胞术检测细胞的凋亡情况。③检索miRDB数据库预测miR-29a、miR-29b和miR-29c的靶基因,绘制韦恩图来观察三个miRNAs预测到的靶基因的差异,同时利用Metascape软件进行靶基因的KEGG pathway分析。④转染 mimics 后用 western blot 检测 CDK2、CDK6、AKT2、Bcl-2 和 Bax 蛋白的表达变化。研究结果①与正常人肝细胞相比,miR-29a、miR-29b和miR-29c在肝癌细胞中表达降低。②在肝癌细胞中转染miRNAs模拟体分别过表达miR-29a、miR-29b和miR-29c后,细胞的增殖活力均受到抑制;肝癌细胞的克隆形成能力降低;细胞凋亡数量增加。⑤miR-29a、miR-29b和miR-29c预测到的靶基因数目均为632个,且三个miRNAs共同预测到的靶基因数目为631个;与预测到的靶基因相关的KEGG信号通路排名前五的分别为 protein digestion and absorption、small cell lung cancer、TNF signaling pathway、Toxoplasmosis 和 mTOR signaling pathway。④肝癌细胞中miR-29a、miR-29b和miR-29c的过表达均抑制了 CDK2、CDK6、AKT2以及Bcl-2的表达和促进了 Bax的表达。研究结论①MiR-29s家族在肝癌细胞中表达降低。②MiR-29s家族抑制了肝癌细胞增殖和促进了肝癌细胞的凋亡。③CDK2、CDK6和AKT2均是miR-29s家族的靶基因,miR-29s家族可能是通过抑制这些基因的表达来抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的。