一.研究目的过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor, PPARs)是一类由配体激活的核转录因子,属Ⅱ型核受体超家族成员,包括PPAR α、 β/δ、γ3种受体亚型。现有的研究显示,PPARs的生物学功能复杂多样,包括调控脂肪和糖代谢、能量平衡,抑制炎症反应,诱导肿瘤细胞分化和凋亡,抑制肿瘤血管生成,抗动脉粥样硬化,降血脂和降血压等。PPAR δ广泛表达于多种器官和组织,在心脏和肾脏表达很高,近十年来的研究发现PPAR δ调控心脏脂代谢,线粒体生物合成,抗炎,抗氧化等重要生物功能。是治疗心脏病变的重要靶标。丹皮酚(Paeonol)是中药牡丹皮和徐长卿的主要活性成分。其药理活性广泛,具有调节血行,疏通血脉之作用,显著的改善血液流变学、抗氧化、抗肿瘤、抗炎等药理活性,一些描述性研究初步显示丹皮酚对实验性心肌细胞损伤可能有保护作用,但其作用机制及确切在体疗效尚不明确。阿霉素(Doxorubicin)属于蒽环类抗癌药,是目前应用最广泛和有效的抗肿瘤药之一,但其主要的严重副作用是累积性、剂量依赖性的心肌毒性反应,可进一步发展成不可逆性心肌损伤,最终导致充血性心力衰竭,目前尚缺乏理想的防治方法。文献排查显示,许多酚类化合物具有PPAR激活作用,但丹皮酚是否具有激活PPAR信号或调控PPAR表达的作用尚无报导。因此,本课题提出丹皮酚可能通过调控心脏PPAR δ信号通路来达到保护心脏的作用。为了验证这一假说,首先证实丹皮酚能调控心肌细胞的PPAR δ活性或表达,然后检测丹皮酚在体治疗是否对阿霉素诱导的心肌毒性具有保护作用,为进一步开发和研制保护心肌细胞的中医药单体提供理论依据。二.实验方法和内容(一)丹皮酚对H9C2(大鼠胚胎心肌细胞)细胞中PPAR δ活性和表达的影响首先采用瞬时转染法将已构建好的质粒：pFATPX3-Luc或PPAR δ启动子报告基因质粒转染至H9C2细胞,以pRL-Luc质粒作为对照,给药处理24小时,然后采用双荧光素酶报告基因检测丹皮酚对PPAR和PPAR δ活性的影响,包括：(1)检测丹皮酚对PPAR活性的影响；(2)检测丹皮酚对PPAR δ启动子活性的影响。最后采用RT-qPCR法检测丹皮酚对PPAR8mRNA表达的影响。(二)丹皮酚对C57BL/6、鼠心肌中PPAR δ活性和表达的影响采用持续腹腔注射丹皮酚(150mg/kg)每天1次,共6天。第7天新鲜收集并冻存心脏组织。提取心脏组织核蛋白和cDNA进行后续检测,包括：(1) RT-qPCR法检测丹皮酚对PPAR δ及其相关靶基因的表达；(2) RT-PCR法检测丹皮酚对PPAR δ转录水平的表达；(3) Western Blot法检测丹皮酚对PPAR δ蛋白水平的表达；(4) PPAR活性检测试剂盒检测丹皮酚对PPAR δ活性的影响。(三)丹皮酚对阿霉素诱导的C57BL/6小鼠心衰模型的保护作用采用持续腹腔注射丹皮酚预处理3天后,进行阿霉素(5mg/kg)腹腔注射每周1次,共4次。同时,隔1天注射丹皮酚,每周3次,共12次。首次阿霉素诱导前和4周结束后采用经胸心脏超声心动图检测各采集1次,共2次,记录4周前后心脏收缩功能指标的变化,包括左室射血分数(EF%)和左室短轴缩短率(FS%)；记录4周体重动态变化；4周结束后,采集心脏重量；计算心脏重量和胫骨长度/体重的比值,评估心脏的相对重量,以此检测丹皮酚对阿霉素诱导的心衰模型的作用影响。采用HE染色法检测心肌的组织结构变化和心脏表面积等和RT-qPCR法检测PPAR δ和心衰功能生物标记物ANP和BNP的表达。三.实验结果(一)丹皮酚对H9C2细胞中PPAR δ活性和表达的影响从双荧光素酶报告基因检测结果得出：(1)丹皮酚可激活PPAR δ启动子活性,且丹皮酚和GW0742(PPAR δ选择性激动剂)结合可显著增强对PPAR活性的表达,并可能增强GW0742对PPAR δ的激动作用；(2)丹皮酚可激活PPAR δ启动子活性,并有一定上调作用。从RT-qPCR法检测结果得出：丹皮酚可上调PPAR δ mRNA的表达。(二)丹皮酚对C57BL/6小鼠心肌中PPAR δ活性和表达的影响首先从RT-qPCR法检测结果得出：丹皮酚可上调PPAR δ的表达且效果显著,然后通过RT-PCR法检测结果得出：丹皮酚可上调PPAR δ转录水平的表达,以及Western Blot法检测结果得出：丹皮酚可上调PPAR δ蛋白水平的表达,最后由PPAR活性试验检测得出：丹皮酚可激活PPAR δ的活性。(三)丹皮酚对阿霉素诱导的C57BL/6小鼠心衰模型的保护作用从4周的体重动态变化结果得出：丹皮酚有效的改善了阿霉素引起的体重减轻情况,由经胸心脏超声心动图检测结果得出：丹皮酚有效的改善阿霉素引起的心脏收缩功能的损害包括：左室射血分数(EF%)和左室短轴缩短率(FS%)显著下降,以及4周后取材测量结果得出：丹皮酚有效的改善了阿霉素引起的心脏体重减小,胫骨长度／体重比值变小,心脏相对体重下降等心衰表现；从HE染色法检测结果得出：丹皮酚可以有效改善阿霉素引起的心脏组织的病理性改变；从PT-qPCR法检测结果得出：丹皮酚有效的抑制了心衰功能生物标记物ANP和BNP的表达,并且丹皮酚可上调阿霉素诱导的心衰小鼠心脏组织中PPAR δ的表达,表明PPAR δ信号通路是其可能的保护机制。四.实验结论(一)丹皮酚可上调H9C2细胞中PPAR δ活性和表达；(二)丹皮酚可上调C57BL/6小鼠心脏组织中PPAR δ活性和表达；(三)丹皮酚激活和上调小鼠心脏组织PPAR δ是其中一个保护阿霉素诱导的心衰的重要机制。