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目的建立同步观察行为学和脑电波变化的槐定碱致痫大鼠癫痫模型,观察清醒状态下槐定碱致痫大鼠行为学和脑电波的变化;探讨丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号转导通路中的主要成员细胞外信号调节蛋白激酶ERK1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2)通路及其活化形式—磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)在槐定碱致痫大鼠海马细胞的表达变化规律及其意义,进而探讨该通路在癫痫发病机制中的作用。方法①Sprague Dawley大鼠随机分为生理盐水对照组和槐定碱致痫组,通过脑立体定位仪将自制埋藏电极植入大鼠海马一周后,腹腔注射槐定碱(sophoridine,SRI)建立急性化学点燃癫痫大鼠模型,对其行为学和脑电图上的痫性放电进行同步观察。②S D大鼠随机分为生理盐水对照组、槐定碱致痫组、苯巴比妥钠(phenobarbital sodium,PBS)﹢槐定碱组和PD98059﹢槐定碱组,应用免疫组化染色方法检测各组大鼠致痫后0.5h、1.5h、5.0h、8.0h海马CA1区和CA3区ERK1、ERK2和p-ERK1/2的免疫阳性神经元数量的变化和应用Western blot方法进一步检测各组大鼠各时间点海马该三种蛋白表达规律;同时采用HE染色方法和电镜技术观察海马CA1区和CA3区神经元组织病理学和形态学的改变。结果1.行为学及大鼠清醒脑电图表现槐定碱致痫组大鼠腹腔注射槐定碱后,大鼠由活动状态逐渐变得安静,随后出现呆滞,部分动物出现呼吸急促,经8.46±1.62min的潜伏期后,大鼠逐渐出现癫痫样发作表现。开始出现须动、点头、咀嚼样动作,尾巴翘起,湿狗样抖动,伴流涎,至0.5h左右开始有面肌抽动、双前肢抬起阵挛或单肢抽搐,随后出现姿势失衡,跌倒,阵挛抽搐,继之发生全身强直,持续36.84±5.69min,点燃率达100﹪,达到Ⅳ级以上发作的成功率为80%,死亡率为20%。在大鼠痫性发作的同时脑电图出现频发性尖波单棘波,棘波、棘慢波,发作性节律波等癫痫样放电。生理盐水对照组大鼠脑电图均为基础波,且无癫痫样放电。槐定碱致痫大鼠癫痫发作过程中伴有与行为相一致的清醒脑电图改变。2.海马神经元组织病理学的改变光镜观察各组大鼠各时间点海马CA1区和CA3区神经元HE染色标本:生理盐水对照组大鼠海马CA1区和CA3区神经元呈圆形或椭圆形,结构正常。槐定碱致痫组大鼠海马CA1区和CA3区神经元损伤最严重,坏死损伤区表现为细胞核固缩,核仁不明显,胞浆浓缩深染,神经细胞发生不同程度的变性坏死。苯巴比妥钠﹢槐定碱组大鼠海马CA1区和CA3区可见少部分变性或坏死的细胞,损伤程度较槐定碱致痫组轻。PD98059﹢槐定碱组大鼠海马CA1区和CA3区可见散在个别神经元损伤,比槐定碱致痫组和苯巴比妥钠﹢槐定碱组损伤程度轻。3.海马神经元形态学的改变电镜下观察各组大鼠各时间点海马CA1区和CA3区神经元超微结构的变化:生理盐水对照组大鼠海马CA1区和CA3区神经元结构正常。槐定碱致痫组,致痫0.5h海马CA1区和CA3区神经元核膜双层结构尚清楚,细胞核出现固缩,线粒体内膜部分损伤,嵴断裂,致痫1.5h核膜双层结构破坏,神经细胞核严重固缩,染色质颗粒状聚集,线粒体肿胀,嵴断裂或消失,毛细血管内皮细胞核固缩,致痫后5.0h、8.0h损伤仍很重。苯巴比妥钠﹢槐定碱组少部分神经细胞核轻度固缩,损伤程度较槐定碱致痫组轻。PD98059﹢槐定碱组大部分神经元结构正常,个别神经细胞核轻度固缩,损伤程度比槐定碱致痫组和苯巴比妥钠﹢槐定碱组轻。4.细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)及磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(p-ERK1/2)免疫组化染色结果生理盐水对照组大鼠海马CA1区和CA3区有少量的ERK1和ERK2表达,p-ERK1/2仅在胞浆内表达弱阳性,致痫0.5h p-ERK1/2表达迅速增强,在神经元的胞核胞浆内都有表达,与生理盐水对照组比较ERK1和ERK2阳性神经元数量明显增多(P﹤0.05),ERK1主要表达在胞核胞浆内,ERK2主要表达在胞浆内,在致痫1.5 h时该三种蛋白阳性细胞数量达到最高值,5.0h时阳性神经元数量回降,8.0h继续回降,但仍高于生理盐水对照组。苯巴比妥钠﹢槐定碱组阳性细胞数量明显低于槐定碱致痫组相应时间点(P﹤0.05),PD98059﹢槐定碱组显著抑制ERK表达,阳性神经元数量低于槐定碱致痫组和苯巴比妥钠﹢槐定碱组(P﹤0.05)。5.细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)及磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(p-ERK1/2)Western blot结果经光密度定量分析显示:生理盐水对照组大鼠海马表达少量的ERK1和ERK2,而p-ERK1/2蛋白含量更少,致痫0.5h该三种蛋白含量开始升高,1.5h蛋白含量达到最高值,5.0h后逐渐回降,三种蛋白表达趋势与免疫组化染色结果一致。槐定碱致痫组与生理盐水对照组相应时间点比较蛋白含量显著增高(P﹤0.05),苯巴比妥钠﹢槐定碱组蛋白含量明显低于槐定碱致痫组,PDPD98059﹢槐定碱组与槐定碱致痫组和苯巴比妥钠﹢槐定碱组比较三种蛋白含量明显降低。结论1.槐定碱致痫大鼠模型可以很好的复制人类的癫痫发作,具有癫痫发作的行为学和电生理学特征。2.槐定碱致痫后诱发了大鼠海马细胞内ERK通路的激活,该通路可能参与了癫痫发作后大鼠海马组织的痫性损害。3.大鼠侧脑室注射PD98059可对癫痫发作引起在体海马神经细胞的损害产生部分保护性作用。