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结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的慢性传染病,MTB可能侵入人体全身各种器官,但主要侵犯肺,称为肺结核。据世界卫生组织(WHO)统计,全世界每年有1000万新发病例,150万人死于结核病。我国高居全球结核病高负担国家的第二位,现有MTB感染人数已达4亿,传染性TB患者达到200万。卡介苗(BCG)作为目前唯一用于预防结核病的疫苗,对于儿童重症结核病如粟粒型结核和结核性脑膜炎具有预防作用,但是对于预防成年人结核病效果不理想,保护率为0-80%不等。目前,很多国家都在研究结核新疫苗,已有200多种的候选疫苗,其中有的正在进行动物模型实验,有的已经进入临床实验。近几十年,随着耐药MTB增多及HIV共感染等问题,加重了结核病的严重性。所以开发新型有效的结核病疫苗迫在眉睫,希望尽快开发出更安全、高效、低成本、并可广泛用于各类人群的新型结核病疫苗。本文以广泛使用的Ad-Easy腺病毒包装系统为基础,构建结核分枝杆菌MPT83重组腺病毒疫苗。首先PCR获取结核分枝杆菌MPT83基因,然后再将MPT83基因重组于穿梭载体pAdTrack-CMV;通过化学转化法将线性化的重组穿梭质粒(pAdTrack-CMV-MPT83)和病毒骨架质粒(pAdEasy-1)共转入大肠杆菌BJ5183,重组穿梭质粒和病毒骨架质粒在BJ5183发生同源重组形成重组腺病毒质粒(rAd-GFP-MPT83);线性化的重组腺病毒质粒转染HEK293细胞,并于HEK293细胞中包装成病毒;mRNA和蛋白水平上检测目的基因的表达;大量扩增腺病毒,体外通过MTT实验初步验证重组腺病毒的免疫原性;体内通过重组腺病毒免疫小鼠,整体荧光成像观察报告基因绿色荧光蛋白(GFP)在小鼠体内的表达与分布,间接跟踪目的基因在小鼠体内的表达情况。结果表明:(1)成功构建结核分枝杆菌MPT83重组腺病毒载体,构建的重组腺病毒载体于HEK293细胞中成功包装腺病毒。通过RT-PCR和Western-Blotting实验,分别于mRNA和蛋白水平上检测均表明结核分枝杆菌MPT83基因在HEK293细胞中表达。(2)MTT实验表明:vAd-GFP-MPT83病毒液比vAd-GFP病毒液具有更强的刺激体外淋巴细胞增殖的能力,证实了目的蛋白具有很强的刺激淋巴细胞增殖的能力,即其免疫原性。(3)小鼠活体实验表明:vAd-GFP-MPT83病毒免疫小鼠后,报告基因GFP于免疫后第4d达到高峰,一直到半个月之后还有很强的表达,同时表达的范围也由原来注射的部位向周边扩散。