食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发生发展是一个多因素、多步骤、复杂的渐进过程，而端粒酶的激活和端粒长度的稳定是细胞永生化和恶性转化改变中重要的一环。端粒（telomere）是位于真核细胞线性染色体末端、由高度保守的简单重复的DNA序列和蛋白质组成的特殊结构，对于保护染色体、防止染色体融合、降解是非常重要的。端粒酶（telomerase）是一种核蛋白，有3种亚单位成分：即人端粒酶RNA（human telomerase RNA，hTR）、端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）和端粒酶相关蛋白I（telomerase associated protein，TPI）组成，近年来大量研究发现端粒酶是细胞永生化和肿瘤发生必不可少的、人体内最具肿瘤特异性和高表达的生物学标志。其中hTERT是端粒酶活性的表达亚基，它几乎存在于所有的恶性肿瘤中，hTERT的表达与端粒酶活性相一致，是端粒酶活性的决定性因素。因此，hTERT成为靶向端粒酶抗癌策略的理想靶点。据报道，91％的食管癌组织中可检测到端粒酶活性及其逆转录酶的表达。利用反义核酸技术，人工合成靶向hTERT的反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides，ASODN），抑制hTERT mRNA表达和端粒酶活性，诱导肿瘤细胞凋亡，是目前进行肿瘤基因治疗的方向之一。但是未经修饰的寡核苷酸（oligonucleotides，ODNs）易被胞内核酸酶降解，作用效果较差。因此，寻找合适的基因载体保护和携带ODNs，使其进入细胞内发挥作用是基因治疗的关键。研究者们利用各种不同的病毒或非病毒基因载体保护和携带ODNs，目前多聚阳离子载体以其稳定、易制备、易进行化学修饰及可以缩合ODN分子形成纳米微粒等独特的优势，保护ODN免受核酸酶的降解的同时，提高了转染效率，日益受到广泛关注，这其中聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）作为一种新型的多聚阳离子纳米载体，是近年来最有临床应用潜能的非病毒基因载体，可以分为线型PEI（line-polyethylenimine，L-PEI）和分支型PEI（branch-polyethylenimine，B-PEI）两种类型，不仅有较强的结合ODN和粘附细胞的能力，而且可偶联上导向配体等，合成更复杂的ODN释放系统，文献报道NGR（N：天冬酰氨酸，G：氨基乙酸，R：精氨酸）多肽，可以与肿瘤新生血管受体CD13特异性结合，具有靶向肿瘤细胞特点，用于体内基因治疗。本实验中制备了线型-聚乙烯亚胺（L-PEI）/端粒酶逆转录酶（hTERT）反义寡核苷酸（ASODN）纳米复合物，在体外转染食管癌细胞株（EC9706），同时制备了NGR修饰的L-PEI/ASODN靶向纳米复合物，静脉注射入裸鼠体内，分别观察hTERT ASODN对EC9706细胞的hTERT基因、蛋白表达的影响，试图验证体内实验中NGR/PEI/ASODN靶向纳米复合物的稳定性和可行性，为其靶向肿瘤的治疗提供实验依据，为该新型纳米载体在食管癌治疗中的应用提供理论基础。方法和材料：1．设计互补于hTERT DNA的ASODN，及一条正义寡核苷酸（senseoligodeoxynucleotides，SODN），制备L-PEI/ASODN纳米复合物，转染EC9706细胞。2．体外细胞实验方法2．1食管癌EC9706细胞，用含10％优质胎牛血清的RPMI-1640培养基，于37℃、5％CO₂饱和湿度的细胞培养箱中常规培养。2．2实验分组：cell组：RPMI-1640+10％胎牛血清培养液（空白对照组）ASODN组：RPMI-1640+10％胎牛血清培养液加入ASODN溶液PEI/SODN组：RPMI-1640+10％胎牛血清培养液加入PEI/SODN复合物PEI/ASODN组：RPMI-1640+10％胎牛血清培养液加入PEI/ASODN复合物2．3分别配制L-PEI/ODN复合物N/P=0，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0溶液，在80v电压下取样电泳；全自动凝胶成像系统观察电泳结果分析L-PEI负载ODN能力。2．4共聚焦显微镜检测EC9706细胞对L-PEI/ASODN纳米复合物的摄入情况；四唑盐比色试验（即MTT法）检测L-PEI/ASODN复合物转染后对肿瘤细胞的抑制作用；免疫细胞化学技术检测细胞内端粒酶hTERT蛋白的表达；一步法RT-PCR检测hTERT mRNA的表达；流式细胞术Annexin-v-FITC和PI双标法检测细胞凋亡。3．体内动物实验方法3．1 BALB/C裸小鼠，皮下注射人食管癌细胞系EC9706，观察体内人食管癌异种移植瘤的生长。制备NGR/L-PEI/ASODN复合物溶液，注射入裸鼠体内。3．2实验分组3．2．1抑瘤实验分组空白对照组尾缘静脉给予生理盐水200μl正义对照组尾缘静脉给予NGR/PEI/SODN200μl静脉给药试验组尾缘静脉给予NGR/PEI/ASODN复合物溶液200μl瘤旁皮下给药组瘤旁皮下注射NGR/PEI/ASODN复合物溶液200μl3．2．2体内药物分布实验分组实验组Ⅰ尾缘静脉给予NGR/PEI/ASODN-FAM复合物溶液100μl实验组Ⅱ瘤旁皮下给予NGR/PEI/ASODN-FAM复合物溶液100μl实验组Ⅲ尾缘静脉给予PEI/ASODN-FAM复合物溶液100μl。3．3抑瘤实验组各组裸鼠接种EC9706细胞2周后注射药物，隔天给药一次，持续给药两周后采取拉颈法统一处死；每4天测定瘤体大小一次，连续测定两周，计算肿瘤体积，绘制生长曲线。3．4体内药物分布实验组各组分别于给药后1、3、6小时后断颈处死，立即取出肝、肾、肺和瘤体组织，制作冰冻切片，激光共聚焦扫描显微镜下观察各组织的药物分布情况。3．5常规病理切片及HE染色，显微镜下观察病理形态学改变。3．6透射电镜观察细胞凋亡情况。3．7免疫组织化学技术检测移植瘤内端粒酶hTERT蛋白的表达。4．统计学分析：实验数据用SPSS10.0统计软件包进行统计学处理。统计学数据用均数±标准差（（?）±s）表示，采用单因素方差分析进行检验；α=0.05作为差别有显著性的检验水准。结果：1．体外实验时，以0.45％的NaCl作为溶媒，配制N/P=10，ASODN浓度为40μg/ml的L-PEI/ASODN复合物，其平均粒径194.0±11.0nm，zeta电位16.8±3.9mv；体内实验中，以5％葡萄糖和0.1％的右旋糖苷-70为溶媒，配制成N/P=6.8的复合物导入裸鼠体内，NGR/L-PEI/ASODN复合物平均粒径128.0±5.0nm，zeta电位26.2±1.2mv。2．体外实验结果：2．1凝胶电泳阻滞实验显示L-PEI/ASODN复合物N/P为6时L-PEI已将ASODN全部结合。2．2共聚焦显微镜观察结果显示L-PEI介导的hTERT反义寡核苷酸可以进入细胞核内。2．3 MTT法检测：L-PEI/ASODN复合物作用24 h时肿瘤细胞增殖出现抑制，并具有时间依赖性；与空白对照组相比有显著差异（p<0.05），正义寡核苷酸（SODN）和单纯ASODN对细胞增殖无明显的抑制作用（p>0.05）。2．4 hTERT蛋白的免疫细胞化学结果判定：空白对照组细胞为阳性着色，胞核和胞浆着棕色颗粒；阴性对照组和转染组细胞为阴性着色，胞浆和胞核着蓝色。2．5 RT-PCR检测：L-PEI/ASODN作用于EC9706细胞48h时，hTERT mRNA水平明显降低，与对照组相比有显著差异（p<0.05）。2．6 Annexin-v-FITC和PI双标凋亡检测法显示转染48h后L-PEI/ASODN组出现明显早期凋亡和晚期凋亡率，分别为38.03％和52.17％。3．体内实验结果：3．1裸鼠肿瘤的生长情况观察：药物治疗后1周，皮下注射组和静脉注射组肿瘤体积明显小于对照组，均存在显著性差异（p<0.05）。3．2共聚焦显微镜观察结果显示：尾缘静脉及瘤旁皮下注射NGR/PEI/ASODN-FAM的两组，药物均集中分布于肝脏和肾脏，其次为肺脏和瘤体，表明复合物在体内主要被肝肾等代谢器官所摄取，且组织内荧光强度随给药时间的延长而逐渐增强。未经NGR修饰的PEI/ASODN-FAM尾缘静脉注射组瘤体组织内观察不到明显的荧光，表明不能有效到达瘤体组织。3．3 hTERT蛋白的免疫组织化学结果判定：空白对照组及正义对照组组织内均可见细胞核/浆内有棕黄色颗粒，皮下注射组及静脉注射组内见细胞浆内有浅棕色颗粒。3．4移植瘤超微结构观察：瘤旁皮下注射组及静脉注射实验组均可见类圆形凋亡小体出现。对照组未见典型凋亡小体。结论：1．本研究中合成的L-PEI/ASODN复合物及NGR/L-PEI/ASODN复合物，均具有较理想的纳米粒粒径和表面电性。2．体外实验中，N/P=10、ASODN浓度为40μg/ml时L-PEI完全负载ASODN，形成纳米级分子复合物，可以快速进入肿瘤细胞浆/核内，保护ASODN免受降解，发挥hTERT ASODN抑制EC9706细胞的增殖活性的作用，且抑制作用具有时间依赖性。3．体内实验中，N/P=6.8的NGR/PEI/ASODN复合物注射入裸鼠体内，实验证明裸鼠在处死之前无明显毒副作用表现；同时在NGR修饰下、L-PEI介导下的hTERT ASODN通过体液循环可以定向到达肿瘤细胞内，发挥抑瘤作用。提示NGR靶向肿瘤细胞作用效果明显，为肿瘤的靶向治疗提供了临床可行性。4．体内外研究观察到hTERT ASODN转染后，EC9706细胞均出现了凋亡，这将为发现端粒酶活性与细胞凋亡的相关性提供有意义的理论基础。5．ASODN转染后hTERT mRNA表达的下降，证实了ASODN对EC9706细胞端粒酶逆转录酶的序列特异性。6．ASODN转染后hTERT蛋白表达被抑制，说明与hTERT mRNA表达具有一致性，且这种抑制作用是在基因水平实现的。