大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)是我国特有的珍稀濒危物种，被誉为“活化石”，其支系起源于晚中新世的始熊猫(Ailurarctos lufengensis)，历经大熊猫小种(Ailuropoda microta)和巴氏亚种(Ailuropoda melanoleuca baconi)。化石证据显示该物种在历史上繁盛一时，曾广布予中国的东部和南部地区。而目前该物种仅存约2500只野生个体，分布在秦岭、四川盆地西缘的岷山、邛崃、大相岭、小相岭以及盆地南缘的凉山等六个山系中，且面临日益加剧的栖息地破碎化的威胁，其生存状况不容乐观。　　虽然有关气候和环境对大熊猫种群遗传格局的影响取得了一系列的研究成果。然而不同的研究所采用的分子标记系统不一致或数量有限，目前在大熊猫的种群遗传格局及历史成因等方面尚无一致或有说服力的结论。2010年，大熊猫全基因组序列图谱的公布为深入研究该物种的种群遗传学提供了一个新的契机。在大熊猫漫长的进化历程中，其基因组序列保留着大量能够反映所经历的历史事件的印记。我们期望通过对该物种个体和群体全基因组信息的分析和解读，能够更深入地探究大熊猫的种群遗传格局、重塑其种群历史并探讨其形成与濒危原因，为制定该物种有效合理的保护措施提供科学依据。　　基于以上研究背景，我们将基因组学的方法应用于大熊猫种群遗传学研究。以已经公布的大熊猫晶晶基因组序列为参考序列，通过对48只大熊猫个体进行全基因组重测序，获得了迄今为止最大规模的大熊猫基因组多态性位点，并进行种群基因组学分析，包括种群遗传多态性的评估、种群遗传结构的检测、种群历史的重构以及大熊猫本地化适应信号的鉴定。主要研究结果如下:　　1.大熊猫全基因组遗传多态性位点的鉴定　　我们选取来自于上述六个山系的34只野生个体进行重测序，包括8个秦岭熊猫、7个岷山个体、15个邛崃山系个体、2个凉山个体、1个大相岭个体、1个小相岭个体。样品数量占野生大熊猫的1.4％-2.1％。另外还选取了14个圈养的山系间杂交个体进行重测序。总共48只个体，共计获得659Gb原始测序数据，平均每个个体得到约13.73 Gb原始数据，其中定位到参考序列的数据492 Gb，平均每个个体为10.25Gb定位数据。有效覆盖91.5％的基因组区域，平均覆盖深度为4.6×。野生个体的平均覆盖深度达到4.7×。从原始数据中鉴定了16，085，433个高质量的单核苷酸多态性位点(SNP)和1，393，149个1-10 bp的插入/缺失(Indel)。其中野生大熊猫的13，020，055个SNP位点，将用予种群遗传学分析。　　2.大熊猫野生种群遗传多态性的评估　　我们用Watterson的θw和Tajima的θπ两个经典指标评佑野生种群的遗传多态性，QIN、MIN和QXL三个种群（详见下面遗传结构的描述）展示了相近的遗传多态性:θw值在1.13-1.37×10-3范围，θπ值在1.04-1.33×10-3范围。尽管这两个指标略低于牛类的群体核苷酸多态性，但是高于人类的遗传多态性，提示大熊猫的三个种群具有较高的遗传多态性，与之前的基于微卫星分子标记得出的结论基本一致。在三个种群中，秦岭多态性最低，QXL的θw和θπ数值最高，可能反映了种群历史和种群大小的不同，但是这一数值的差异也可能与样本量有关系，或与群体是否有遗传亚结构有关系。　　3.大熊猫野生种群遗传结构的检测　　我们利用野生群体的常染色体SNP数据进行种群遗传结构frappe和ADMIXTURE检测、主成分分析(PCA)、邻接法构建系统树以及遗传分化指数FST的估算。综合考虑上述几个方法的检测结果，将野生群体分为三个种群遗传簇:秦岭山系的大熊猫为QIN种群，岷山山系为MIN种群，而邛崃、大相岭、小相岭及凉山一起聚为QXL种群。QIN与MIN的遗传分化指数FST为0.23，QIN与QXL的遗传分化值约为0.22。而MIN与QXL的FST值为0.15。FST分析提示QIN与MIN及QXL的遗传分化程度较高。另外frappe和ADMIXTURE检测结果还显示QXL可能具有种群亚结构(K=4-6)，但由于本次研究中凉山、小相岭和大相岭的样本量小（分别为n=2、1、1个体），可能还需要以后充分采样的进行下一步研究。　　4.大熊猫种群历史的构建　　大熊猫有着悠久的进化历史，但以往研究对其种群历史的构建都比较粗糙。　　(1)基于单个基因组的杂合位点构建种群历史　　基于已发表的大熊猫晶晶全基因组序列的杂合位点密度分布，通过顺序配对马科夫溯祖模型(pairwise sequentially Markovian coalescent model，PSMC)重建其有效种群大小波动的历史，覆盖从约8百万年前(eight millionyears ago，8 MYA)到1万年前(ten thousandyears ago，10 KYA)的连续交化的种群历史，首次揭示了从始熊猫到小种大熊猫再到巴氏亚种的有效种群数量变化。　　(2)基于多个种群SNP位点构建种群历史　　基于本研究中重测序获得的野生大熊猫SNP位点，通过扩散近似法推断种群历史软件(diffusion approximations for demographic inference，(6)a(6)i)对QIN、MIN和QXL三个种群联合频谱的模拟，我们构建了从～300 KYA到现在的近期种群历史，弥补了PSMC分析中未能揭示的10 KYA到现在的种群历史。(6)a(6)i揭示了大熊猫的两次种群分化、种群数量波动及迁移交流等事件。　　(3)大熊猫种群历史　　综合上述两个方法，我们完整的重塑了大熊猫种群从起源(～8 MYA)到现在的种群波动历史事件，包括两次种群扩张、两次种群瓶颈、两次种群分化，形成目前的三个现生种群的遗传格局。　　第一次种群数量顶峰出现在1MYA左右，随后种群出现收缩，直到～300 KYA到达谷底处于瓶颈期，然后在40 KYA种群恢复繁盛状态，在20 KYA种群剧烈下降发生第二次种群瓶颈。　　第一次分化发生在～300 KYA的瓶颈期，QIN种群分化出来;第二次种群分化发生在～2.8 KYA，MIN和QXL形成两个种群。至此三个现生种群都已经形成。但是此后三个种群数量却呈现不同的波动状态:QIN种群收缩，MIN和QXL有不同程度的增长。　　5.大熊猫种群动态波动的影响因素　　我们试图从中国黄土质量堆积率重构的古气候数据、大冰期-间冰期、系统进化生物学及古生物学化石等方面探究影响大熊猫种群历史波动的因素。大熊猫种群收缩甚至瓶颈，正处于气候寒冷的冰期。大熊猫种群繁盛时期，都伴随着冰川退缩、气侯温暖的间冰期。　　古气候显示约1MYA以来，冰川旋回周期变为10万年(one hundred thousandyears，100 kyr)主导，意味着冰期-间冰期周期延长，气候寒冷，大规模冰川发育扩张，可能对大熊猫种群产生了深远的影响。Naynayxungla冰期(0.78-0.50 MYA)、倒数第二次冰期(Penultimate Glatiations，0.30～0.13 MYA)以及～20 KYA的末次冰期(Last Glacial Maximum，LGM)和山地冰川(如贡嘎冰川Ⅱ，～15-20 KYA)等冰期不仅使大熊猫种群处于收缩或接近崩溃的边缘，可能还促成了不同大熊猫时间种的更替。当气候波动，气温回升，处于间冰期，冰川退缩，大熊猫的种群开始复苏和扩张。种群数量的第二次达到顶峰，正好和30 KYA-40 KYA的中国大潮期的温暖气候相吻合，这一时期栖息地充足，食物丰沛，促进了巴氏亚种的繁盛。综上，古气候的波动主导了当时大熊猫种群数量的变化。　　另外，我们通过对一系列史料和记载的分析，我们认为大熊猫种群的MIN和QXL的种群分化及近期的种群数量变化与近3，000年以来栖息地周边的人类的活动密切相关。　　6.大熊猫本地化适应选择信号的检测　　我们应用多种基于FST的选择信号检测方法对三个野生种群的基因组编码区的多态性位点进行检测，获得了一系列具有选择信号的位点，这些位点可能参与了大熊猫本地化适应过程。其中QIN和Non-QIN（即MIN和QXL）种群间检测到134个受到定向选择的SNP位点和212个受到平衡选择作用的位点。在MIN和QXL种群间检测到52个受到定向选择的位点，没有检测到平衡选择的信号。这些位点分布于味觉嗅觉感知系统、免疫、信号传导等方面的相关基因，暗示大熊猫不同的种群在适应当地环境过程中需多个系统相关基因受到了选择作用。这些位点在大熊猫中的生物学功能还有待进一步的实验验证。　　综上所述，我们建议减少人类活动对大熊猫的负面干扰，尽量降低每个野生种群内部的破碎化程度，维持种群遗传多态性。通过异地放归给小种群补充新鲜血液，增加基因流，不失为维持其种群遗传力和多样性的有效方式。我们建议在制定放归策略时，综合考虑选择和本地化适应的影响，尽量选取相似的或者相近遗传背景的野生群体作为放归地。本研究为其他濒危物种保护制定长期合理的科学方案提供一个参考案例。