论文部分内容阅读
褐飞虱Nilaparvata lugens(Sta1),属半翅目飞虱科,是我国和亚洲许多国家水稻生产上的重要害虫。由于化学杀虫剂的长期、大量不合理使用,褐飞虱已经对多数农药产生了抗药性,再加上褐飞虱是典型的再猖獗害虫,严重影响了农业生产。因此,对褐飞虱抗药性和再猖獗的研究成为了必然。虽然褐飞虱抗药性和再猖獗的生态机制已经得到了非常广泛的研究,但它们的生理机制,目前还不是十分清楚。本论文以褐飞虱抗药性和再猖獗相关基因为研究对象,首先,通过有机磷农药刺激褐飞虱,检测褐飞虱体内基因表达的改变,来探索再猖獗或抗药性的生理机制；其次,通过RT-PCR、RACE方法克隆得到了与抗药性相关的两种乙酰胆碱酯酶基因,对序列进行了分析,Real time PCR的方法检测了表达量差异；最后,采用RNA干扰的方法,对两种乙酰胆碱酯酶基因功能进行研究,并应用昆虫细胞表达系统表达该基因,以期比较两种酶的差异。本论文获得的主要结论如下：1.三唑磷诱导褐飞虱体内基因变化的研究通过抑制消减杂交的方法,构建了三唑磷诱导的cDNA文库,总共得到了402个差异表达cDNA克隆。实时定量PCR分析确定了褐飞虱五龄若虫农药处理后第3天差异表达的6个候选基因。这些候选基因分别编码褐飞虱的卵黄原蛋白、bystin、多药抗性蛋白(MRP)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、吡咯啉-5-羧酸还原酶(P5CR)和羧酸酯酶。羧酸酯酶基因表达量在农药处理后出现了明显上调,验证了褐飞虱对有机磷农药产生的抗药性与羧酸酯酶活性的增强有关。我们的实验结果说明了这些表达上调的基因可能参与了诱导褐飞虱雌虫生殖或对农药抗药性产生的机制中来。2.褐飞虱两种乙酰胆碱酯酶基因的克隆和序列分析我们克隆得到了褐飞虱两种乙酰胆碱酯酶基因全长cDNA序列。Nlace1基因cDNA片段全长2842bp,包含一个编码790个氨基酸的开放阅读框。Nlace2基因cDNA全长2852bp,开放阅读框编码672个氨基酸。两种乙酰胆碱酯酶之间的核苷酸同源性为40%。我们构建了来自32种昆虫的59个乙酰胆碱酯酶的系统进化树,分析表明Nlace1与德国小蠊和黑尾叶蝉的同源性最高,而Nlace2与黑尾叶蝉的距离最近,同源性最高。通过实时荧光定量PCR技术,分析了AChE mRNA表达水平的变化,结果表明在褐飞虱发育的不同时期和不同部位AChE1的表达量都要明显高于AChE2,前者可能是褐飞虱两种乙酰胆碱酯酶中起主要作用的酶。本研究结果为褐飞虱抗药性的研究奠定基础,并能促进作用于Nlace1的新型选择性杀虫剂的研究开发。3.褐飞虱AChE基因的双链干扰及真核表达通过RNA干扰技术,研究了注射两种AChE dsRNA对褐飞虱AChE mRNA表达水平和若虫生长发育的影响。qRT-PCR分析表明在双链干扰后72h褐飞虱若虫的mRNA表达水平干扰效果最显著。其中注射AChE1dsRNA的若虫,AChE1基因表达的下调最明显；注射AChE2dsRNA的若虫,AChE2下调最大；注射AChE1&AChE2dsRNA的若虫,两种基因都得到了一定程度的沉默。但发现褐飞虱两种AChE基因被沉默后,都并未对若虫生存产生影响。通过农药处理,我们发现注射dsRNA的若虫对农药的敏感性增加。其中,注射了AChE1和AChE1&AChE1dsRNA的若虫敏感性变化最大。因此我们推测,褐飞虱AChE1是褐飞虱体内有机磷和氨基甲酸酯类农药的主要作用靶标酶。另外,还构建了褐飞虱两种AChE体外表达载体,以期研究它们之间的差异,但在昆虫细胞中没有得到表达。