论文部分内容阅读
背景与目的化学治疗是治疗肿瘤的经典方法之一,但是随着治疗的进行或者肿瘤本身对化疗药物反应性的不同,许多肿瘤对化疗药物产生耐药,敏感性降低,加之化疗引起骨髓抑制、神经毒性、心血管毒性等毒副作用,不仅严重影响患者生活质量,也限制了化疗药物的应用,增加了临床肿瘤治疗的难度。因此如何克服化疗耐药性、增加化疗敏感性及降低药物毒副作用,提高化疗效果,是肿瘤治疗领域亟待突破的问题之一。近年来关于增加化疗的敏感性和克服化疗耐药性的研究表明,蛋白酶体抑制剂与化疗药物联合使用,可有效地促进肿瘤细胞凋亡,增强化疗敏感性,克服化疗耐药性。蛋白酶体抑制剂MG132单独或与化疗药物联合应用均能有效的抑制肿瘤的生长。肿瘤的多药耐药性与肿瘤细胞的能量代谢水平有关,因为多药耐药蛋白对化疗药物的转运需要ATP的供能,有研究表明,调节肿瘤细胞能量供应疗法可以提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。但是改变细胞的供能,尤其是减少细胞的供能,是否提高蛋白酶体与化疗药物联合使用的疗效,目前的报道不多。本研究在无糖培养基中分别添加右旋葡萄糖(D-glucose, D-G)或左旋葡萄糖(L-glucose, L-G),改变培养肿瘤细胞的供能条件,并观察在不同供能条件下,蛋白酶体抑制剂MG132与广谱抗癌药物紫杉醇联合应用对MCF-7和K562细胞的抑制作用,并初步探讨其作用机制。材料和方法1材料1.1细胞株:K562细胞株:购自中国科学院血液学研究所;人乳腺癌MCF-7细胞株,购自广州医学院实验中心。1.2试剂:紫杉醇(Paclitaxel,海南中化联合制药工业有限公司生产,国药准字H20057065);D-G (汕头市光华化学厂);L-G(上海西域机电有限公司);MG132(Alexis);紫杉醇溶于NS -20℃保存,MG132溶于DMSO -20℃保存。2方法2.1细胞培养:K562细胞培养于RPMI1640完全培养基中,隔天传代一次;MCF-7细胞培养于RPMI1640培养基中,每两天用0.25%胰蛋白酶(含EDTA)消化传代一次;置于37℃5% CO2培养箱中培养。D-G及L-G完全培养基为含10%胎牛血清的无糖RPMI1640中分别添加D-G或L-G,并使其终浓度分别为2g/l。实验取对数生长期细胞传代离心,调整细胞浓度,用以上配好的D-G或L-G完全培养基重悬细胞,并按以下实验分组进行实验。2.2实验分组:实验分为阴性对照组、紫杉醇组、MG132组以及紫杉醇联合MG132组。MG132和紫杉醇的浓度根据不同的实验有所不同,紫杉醇的浓度范围是20nM/L～10μM/L,MG132的浓度范围是0.625μM/L～10μM/L。2.3细胞活力测定:MTS法检测MG132与紫杉醇对K562细胞及MCF-7细胞活力的影响,以及确定适当的浓度范围。2.4 MG132与紫杉醇对K562细胞死亡情况的影响:采用流式细胞术以及荧光显微镜观察各组细胞在两种供能条件下各组细胞的存活情况。2.5 MG132与紫杉醇对K562细胞凋亡蛋白Bax及PARP的影响:用Western blotting方法检测各组细胞Bax及PARP的表达水平。2.6 MG132与紫杉醇对K562细胞周期的影响:用流式细胞术(FCM)检测各组用药对K562细胞周期的影响。结果1 MG132和紫杉醇对肿瘤细胞活力的影响:1.1 MG132 2.5μM～10μM作用MCF-7细胞24h,细胞相对活力值为67.96%～52.24%,与对照组相比具有统计学差异(p<0.05);MG132 1.25μM以下浓度对MCF-7细胞没有明显抑制效应。1.2 D-G及L-G培养条件下,紫杉醇对MCF-7及K562细胞抑制作用随剂量的增加而增强。紫杉醇5μM、10μM作用MCF-7细胞36h,在D-G培养条件下,对应细胞活力分别为49.05%、49.09%,L-G条件5μM、10μM对应细胞活力分别为47.57%、35.09%,与对照组相比具有统计学意义(p<0.05);D-G条件下1μM、5μM、10μM的紫杉醇作用K562细胞24h对应的细胞相对活力分别为77.10%、63.35%、54.61%,与对照组相比具有统计学意义(p<0.05);L-G条件下5μM、10μM紫杉醇对应细胞相对活力分别为59.06%、50%,与对照组相比具有统计学意义(p<0.05)。1.3在MCF-7细胞中D-G及L-G条件下联合用药组与单独用药组相比均没有统计学差异,而在K562细胞中D-G条件下MG132 1μM与1μM、5μM、10μM紫杉醇联合应用的细胞活力值分别为50.97%、29.63%、15.41%,与单独用药组比较,统计学差异显著(p<0.05)。2 MG132和紫杉醇对K562细胞死亡的影响:2.1流式细胞术检测细胞凋亡:2.1.1L-G条件下MG132 1μM与紫杉醇5μM联合细胞凋亡显著增加,与单用药组相比具有统计学意义(p<0.05),其凋亡率显著高于D-G条件下的凋亡率(p<0.05),在L-G下紫杉醇5μM单药作用凋亡明显,与对照组相比具有统计学意义(p<0.05)。D-G条件下MG132 1μM与紫杉醇5μM联合细胞凋亡也有增加,与单用药组相比具有统计学意义(p<0.05)。2.1.2 L-G条件下MG132 1μM与不同浓度紫杉醇20nM、1μM联合均显示出明显增加凋亡诱导的效应,并有时间依赖性。且L-G条件下MG132 1μM与紫杉醇1μM联合应用24h时,K562细胞的凋亡增加显著。2. 2 PI染色细胞存活情况观察:结果显示,L-G条件下MG132 0.5μM与紫杉醇20nM联合用药比单独用药细胞死亡增加显著,细胞坏死增多;MG132 1μM与紫杉醇200nM联合L-G条件下联合用药细胞死亡显著增加。D-G条件下,MG132处理组和联合用药组,细胞死亡显著。3. MG132和紫杉醇对K562细胞Bax和PARP的影响:D-G条件下MG132处理组细胞的Bax聚集明显, L-G条件下Bax也有聚集;D-G条件下联合用药组细胞的PARP切割片段显著增加,L-G条件下没有增加。4 .MG132与紫杉醇联合应用对K562细胞周期的影响:L-G条件下,紫杉醇20nM分别与MG132 0.5μM或者MG132 1μM联合处理K562细胞时,细胞周期主要阻滞于G2-M期;随着药物处理细胞的时间从24h延长至48h时,联合处理组的细胞阻滞于G2-M期的百分比增多。紫杉醇20nM与MG132 1μM联合组的凋亡峰百分比亦增加.结论1.降低细胞的能量供应时,与单独用药组比较,低浓度的紫杉醇(20nM)与低浓度的MG132(0.5μM或1μM)联合应用时,阻滞细胞的周期于G2/M期,并明显增加K562细胞的凋亡和死亡。2.降低细胞的能量供应,能够增强K562细胞对紫杉醇和MG132两药联合应用的敏感性。