第一部分：单纯FSH缺陷患者的临床特征及治疗经过　　目的：根据患者临床特征，明确单纯FSH缺陷这一罕见疾病的诊断标准及治疗原则；通过对自然界建立的极低水平FSH模型的研究，进一步揭示FSH的生理功能及其在卵泡优势化过程中必不可少的作用。　　方法：嘱患者停止任何内分泌药物治疗三个月后，晨起8时，来我院接受下述检查：ACTH、TSH、GH及GnRH兴奋试验以评估垂体功能；性激素、B超检查以评估卵巢功能；染色体、垂体核磁及肾上腺超声检查以鉴别诊断及明确病因。其中，性激素采用化学发光免疫分析法进行检测。检测过程均由西门子公司仪器自动完成。征得患者本人同意后，利用B超及性激素检查，动态监测促排助孕过程中卵泡发育情况，根据卵泡发育调整用药剂量，绘制治疗过程中卵泡发育变化图及性激素波动曲线。　　结果：　　1、患者临床特征　　1.1临床症状：原发性闭经、原发性不孕　　1.2体格检查：似阉人体征、乳房发育Tanner III级。　　妇科检查：子宫发育不良，大阴唇发育正常，小阴唇发育较差，双附件未扪及异常。　　1.3家族史：患者父母为姨表近亲，家族无月经紊乱病史。　　1.4实验室检查　　1.4.1卵巢来源性激素（人工周期治疗停止3个月）：　　FSH0.08-0.47 mIU/ml、 LH27.11-64.53 mIU/ml、 E216.62 pg/ml、 T37.44ng/dl、PRL20.67 ng/ml、 P0.07ng/ml、 AMH3.05ng/ml、 INB1.23↓pg/ml。　　1.4.2肾上腺来源激素（未服用任何类固醇激素类药物）：DHEA2150↓nmol/l、AN6.06↑nmol/l。　　1.4.3垂体来源激素：ACTH、TSH、GH均正常。　　1.4.4 GnRH兴奋试验：戈那瑞林注射30分钟，LH达峰值，较基础值（49.89）升高4倍左右（>200）；而注射前后FSH无波动。　　1.4.5染色体核型分析：46，XX　　1.5影像学检查：　　垂体核磁、肾上腺超声均未见明显异常。　　（人工周期治疗停止3个月）B超提示子宫发育不良（2.8×2.1×1.9cm3），双侧卵巢内直径≤3mm的窦卵泡数6个。　　2、患者治疗结局　　经过妈富隆降低内源性LH水平+尿促性腺激素促排助孕治疗两周期，患者左右卵巢内最大卵泡直径可达1.9cm，血清E2可达735pg/ml，HCG后可成功排卵，但均未妊娠。　　结论：　　1、依据疾病的上述临床特征，可将患者确诊为单纯FSH缺陷。　　2、尽管FSH水平极低，但LH水平较高，这一现象从某一侧面提示，病因可能并非源于下丘脑层面。　　3、GnRH兴奋试验结果提示，垂体对促性腺激素的合成及分泌功能正常。由此可以推测，FSH的极低水平，可能与编码其自身的基因存在缺陷有关。　　4、在体内几乎无FSH存在的情况下，本例患者卵巢内仍有6枚早窦卵泡（<3mm）。这提示，早窦卵泡可能与窦前卵泡一样，均为非激素依赖性生长卵泡。　　第二部分：患者及其家系全外显子基因测序　　目的：通过对患者及其家系进行FSHβ亚基全外显子基因测序，了解编码FSHβ亚基的基因是否存在突变，以验证单纯FSH缺陷的病因来源于编码FSHβ亚基的基因层面。方法：将采集到的患者及其家系全血样本，置于EDTA抗凝管中，冰盒运输至华大基因公司。利用sanger测序技术——双脱氧末端终止法，对患者及其家系进行FSHβ亚基全外显子测序。　　结果：　　患者及其家系FSHβ亚基全外显子测序结果：　　无义突变：三号外显子第184位核苷酸发生C-T突变，致使原本应编码97位精氨酸的密码子被提前出现的终止密码子取代（Arg97X），该无义突变截断了97-111位氨基酸的表达。患者为Arg97X纯合突变基因型，患者外祖母、父母、姐姐均为Arg97X杂合突变基因型，患者祖父的FSHβ亚基未发生任何突变，为野生型。　　单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）：患者及其家系六人当中，3号外显子第69位核苷酸均发生了C-T纯和突变，经查证，该同义突变在中国人群的发生概率为69.5％，为单核苷酸多态性位点。　　结论：　　1、根据患者临床特征及其双亲不良妊娠史，推断Arg97X纯和突变属于单纯FSH缺陷多种基因突变类型中较为严重的可致死亚型，即使少量纯合突变的后代可存活，亦因生育功能的丧失注定被自然界淘汰。　　2、根据已揭示的FSHβ晶体结构的部分内容，推断Arg97X突变既破坏了FSHβ亚基的稳定性，又抑制了α-β异源二聚体的形成，进而影响FSH免疫及生物活性的发挥。　　第三部分：野生型及Arg97X突变型FSHβ亚基体外验证实验　　目的：通过基因扩增、载体构建及细胞转染技术，构建可编码Arg97X突变型FSH的细胞模型，为研究该突变对FSH免疫活性及生物活性的影响打下基础，为揭示FSH生理功能及空间结构的全貌提供依据。　　方法：　　1、设计引物：根据第二部分测序结果，设计出野生型及突变型FSHβ基因片段的两对引物。为使质粒所携带目的基因的转录、翻译过程与待转染细胞内源性基因的转录、翻译区分开，拟在目的基因3’端插入HIS标签。由此，野生型FSHβ及突变型FSHβ的正向引物相同，反向引物不同。　　2、基因扩增：以人体子宫肌瘤组织中提取的RNA为模版，根据上文设计的两对引物，分别进行基因扩增。对获得的DNA产物进行纯化，以获取野生型、突变型FSHβ基因片段。　　3、载体构建：利用HindIII、EcoRI，分别对获得的野生型（wide type）、突变型(mutant)FSHβ片段及pcDNA3.1(+)载体进行双酶切。然后，利用T4连接酶将野生型FSHβ片段、突变型FSHβ片段分别与pcDNA3.1(+)上相应的酶切位点结合，以获得pcDNA3.1(+)-FSHβ（WT）及pcDNA3.1(+)-FSHβ(MU)载体。　　4、细胞转染、PCR、western-blot、化学发光法：将三组质粒：pcDNA3.1(+)-FSHβ（WT）、pcDNA3.1(+)-FSHβ(MU)、pcDNA3.1(+)空质粒(CK)瞬时转染进中国仓鼠卵巢细胞内，培养72小时后，提取细胞裂解液行PCR及western-blot检测，提取细胞培养上清行化学发光检测，分别判断质粒是否转染成功？突变型FSHβ基因能否在细胞内成功进行转录、翻译？能否分泌入上清并发挥免疫功能？　　结果：　　1、细胞裂解液PCR结果：　　WT组检测到了野生型FSHβ的mRNA，证实野生型FSHβ可在细胞内成功转录；　　MU组检测到了突变型FSHβ的mRNA，证实Arg97X突变型FSHβ可在细胞内成功转录；　　CK组既未检测到野生型FSHβ的mRNA，也未检测到突变型FSHβ的mRNA，提示该组样品内无FSHβ（带有HIS标签）转录发生。　　2、细胞裂解液western Blot结果：　　WT组检测到了野生型FSHβ蛋白表达，证实野生型FSHβ可在细胞内成功翻译；　　MU组检测到了突变型FSHβ蛋白表达，证实Arg97X突变型FSHβ可在细胞内成功表达；　　CK组未检测到带His标签的蛋白表达，提示空质粒组无目的蛋白表达。　　3、细胞培养上清化学发光法检测结果：　　四组（WT、MU、CK、media）上清中，均能检测到FSH，且FSH介于1.92-2.12mIU/ml之间，差异无统计学意义，提示化学发光法检测到的FSH可能来源于DMEM/F12培养基，WT及MU组上清中未检测到具有免疫活性的FSHβ。　　结论：　　1、上述结果证实，pcDNA3.1(+)-FSHβ(WT)及pcDNA3.1(+)-FSHβ(MU)载体构建成功。野生型及突变型FSHβ基因均可在细胞内成功转录、翻译，但均无法由胞内分泌到胞外。　　2、野生型FSHβ亚基分泌失败，提示只有当α及β亚基结合后，FSH、甚至所有糖蛋白激素，方能分泌出胞外，发挥免疫及生物学功能。　　3、在患者体内存在正常数量α亚基的情况下（患者TSH水平正常），Arg97X突变型FSHβ亚基仍无法由垂体分泌至外周血液循环，提示该突变的存在，破坏了α及β异源二聚体的结合，进而影响了FSH免疫及生物学功能的发挥。