大口黑鲈(Micropterus salmoides (Lacépède)),俗名加州鲈,隶属鲈形目(Perciformes)、鲈亚目(Porcoidei)、太阳鱼科(Cehtrachidae)、黑鲈属(Micropterus),是我国重要的淡水养殖品种之一。但是近年来,养殖大口黑鲈出现的种质退化,生产性能下降的问题,制约大口黑鲈养殖业的发展。因此,培育出生长性状优良的大口黑鲈养殖新品种成为当务之急。在常规选育基础上开展的分子标记辅助育种已经成为当今鱼类遗传改良的重要研究方向。分子标记辅助育种是借助分子标记对目标基因和目标性状进行转移和选择,可以有效提高性状选择的效率,减少育种过程的盲目性,缩短育种周期。本研究采用候选基因法筛选与大口黑鲈生长相关的垂体特异性转录因子(pituitary specific transcription factor1, POU1F1)和生长抑素前体(preprosomatostatin, PSS)的SNPs位点,为大口黑鲈分子标记辅助育种奠定基础。1. POU1F1 cDNA序列和启动子序列克隆垂体特异性转录因子(pituitary specific transcription factor1, POU1F1)蛋白对垂体前叶胚胎发育以及生长激素(Growth Hormone, GH)等基因的表达有重要的调节作用。本研究采用RT-PCR技术克隆了大口黑鲈垂体特异性转录因子POU1F1 cDNA序列,利用GenomeWalker法获得了大口黑鲈POU1F1启动子序列1629bp。经过与鲤鱼的POU1F1基因组序列及cDNA序列进行比对,推测大口黑鲈的POU1F1转录起始位点位于-620bp处,其POU1F1完整的cDNA序列为3141p。其中,5′-UTR为620bp,3′-UTR为1393bp,编码区为1128bp,编码375个氨基酸,与黑鲷、金头鲷的POU1F1编码区的氨基酸相似性最高,为88%;其次为虹鳟,75%。对其启动子序列进行转录元件分析,预测存在4个八聚体转录因子1(Oct-1)结合位点等启动子基本转录元件,1个Homeobox转录因子结合位点,2个cAMP反应元件结合蛋白(CREB)结合位点和TATA框。2.POU1F1 SNPs位点的筛选和生长相关性分析采用直接测序发现大口黑鲈POU1F1启动子序列的-18和-183两个位点存在SNPs,且利用限制性内切酶AluⅠ和BsrBⅠ对两个突变位点进行检测只发现两种单倍型A和B。对养殖群体内126尾个体进行不同单倍型的基因频率分析和生长关联分析,结果表明,单倍型A的等位基因频率为0.246,单倍型B的等位基因频率为0.754;群体关联分析表明,基因型为AA型和AB型的个体在体重、体长、全长、体高、体宽方面明显高于BB型个体,但基因型为AB型和AA型的个体之间在体重方面没有明显差异。为了进一步验证POU1F1启动子两个SNPs与各生长指标的相关性,于2010年10月采集样本量为293尾的大口黑鲈随机群体。关联分析表明,基因型为AA型和AB型的个体在体重、头长、尾柄高方面均显著高于BB型个体(P<0.05),体长、全长、体高和尾柄长方面的差异不显著,但仍有优于基因型为BB的个体的趋势,基因型为AB型和AA型的个体之间在上述各生长性状上没有明显差异。考虑到关联分析可能受遗传背景差异的影响,进一步构建POU1F1启动子基因型均为AB的全同胞家系。随机选取后代67尾进行单倍型的生长相关性分析,发现基因型为BB的个体在平均体重、全长、体长方面明显小于基因型为AA和AB的个体。为检测发现的POU1F1启动子区域的突变是否影响到POU1F1的转录以及是否影响到生长激素的表达,提取AB×AB全同胞家系不同基因型后代的垂体总RNA进行反转录,利用实时定量PCR技术对POU1F1启动子区域不同基因型个体的POU1F1和GH的转录水平进行研究发现,POU1F1的表达量在三种基因型的个体间并无明显差异,但GH基因的表达量差异显著(P<0.05),BB型个体的GH基因表达量最高,显著高于基因型为AA和AB的个体的表达量。推测该单倍型只是与生长性状相关的分子标记,与个体POU1F1和GH的转录水平无必然联系。以上三个群体关联分析的结果都表明,获得的大口黑鲈垂体特异性转录因子基因上的该单倍型标记与生长密切相关,可以考虑将该基因作为影响大口黑鲈生长性状的重要候选基因,应用于大口黑鲈分子标记辅助育种。3.生长抑素前体cDNA和基因组序列的克隆及序列分析生长抑素(somatostatin, SS)参与调节垂体分泌GH,编码SS的PSS(preprosomatostatin)基因有PSSⅠ、PSSⅡ和PSSⅢ三种。本研究利用RT-PCR、GenomeWalker和3′Race技术克隆了PSSⅠ和PSSⅢ的部分基因组和cDNA序列。PSSⅠ的DNA序列1626bp,第二外显子为1402-1626的225bp, 1-1401可能为内含子部分,未得到第一外显子序列,其cDNA序列的3′-UTR有221bp。PSSⅢ的DNA序列共2439bp,启动子序列1751bp,第一外显子106bp,位于1752-1857bp处,第一内含子355bp,位于1858-2212bp处,第二外显子227bp,位于2213-2439bp处;3′Race法得到其cDNA序列3′-UTR 307bp。对PSSⅢ启动子区转录元件进行分析,预测存在TATA框、CAAT框、GATA框和5个八聚体转录因子1(Oct-1)结合位点等启动子基本转录元件,还有Homeobox转录因子结合位点5个,cAMP反应元件结合蛋白(CREB)结合位点9个,Homeodomain转录因子(HOMF)结合位点8个,BRNF结合位点4个,热激因子(HEAT)结合位点1个,EVI-1结合位点1个。4.生长抑素前PSSⅢSNPs位点的筛选及相关性分析利用直接测序法在PSSⅢ启动子上发现了5个SNPs位点,分别为-870bp(A/C)、-448bp(C/T)、-101bp(A/G)、-54bp(C/T)和-24bp(C/T),并对其在样本数为293的随机群体中的基因型频率进行了统计,介于0-93.5%之间不等。关联分析表明,大口黑鲈PSSⅢ启动子上的-870bp、-448bp、-54bp和-24bp 4个SNPs与其生长性状无显著相关性,但-101bp处的A/G突变与体重、体长、全长、尾柄长和尾柄高5个生长指标显著相关。-101位点的碱基为A时-102→-98的序列AAAC恰为Pax2结合位点的核心碱基,当该点突变为G时该结合位点消失。