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背景:人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)和人类诱导性多潜能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs),统称为人类多能干细胞(human pluripotent stem cells,hPSCs),具有自我更新、无限增殖的能力,可分化成人体所有类型的细胞。输血治疗是当今临床重要的治疗手段,而血源紧张、输血传染病等问题给临床应用的安全性和广泛性带来了巨大的挑战。因此,能否在体外将hPSCs成功诱导分化并大量扩增造血干细胞和功能成熟血细胞,是现今hPSCs研究的一个重要方向。hPSCs不仅为再生医学的研究提供了较好的细胞来源,并且为建立特异疾病模型,最终实现精准医疗和个体化治疗提供了可能。最近几年,各实验室关于hPSCs体外向红系细胞的诱导的研究逐步成熟,而膜蛋白作为其重要的功能蛋白,在维持红细胞的形态及功能特性方面都有重要的作用。因此,对于hPSCs来源各发育阶段的红系细胞的膜蛋白的研究必不可少。本实验室此前已有关于hESCs向红系细胞的诱导生成及功能的重要报导,但尚未对hESCs来源红系细胞的膜蛋白的表达情况及发育模式做深入研究。目的:本实验拟在体外半固体培养条件下分别诱导hPSCs和人脐带血(human cord blood,hCB)来源单个核细胞中的CD34阳性细胞(hCB-MNCs-CD34+细胞)分化为红系细胞。本研究以hCB-MNCs-CD34+细胞来源红系细胞的膜蛋白表达情况为参考,通过将两者细胞的形态和膜蛋白的表达情况进行比较,比较两种来源红系细胞膜蛋白的早期发育以及后期成熟过程的异同,期望为建立红系细胞膜相关疾病模型及药物筛选提供一定的依据。方法:将hPSCs与经13.3GrayX射线照射的小鼠AGM-S3基质细胞(mAGM-S3)共培养,在第12天“收割”大量“鹅卵石”样(cobble stone-like cells,CS)的造血干/祖细胞,同时,采用磁珠分选技术分选出人脐带血单个核细胞中的CD34+细胞,分别将以上两种细胞在半固体条件下向红系诱导培养。本课题以glycophorinA阳性细胞(GPA+细胞)为主要研究对象,将hCB-MNCs-CD34+细胞诱导而来的红系细胞的膜蛋白的研究结果作为参照。实验采用瑞姬氏(May-Grunwald-Giemsa,MGG)染色观察两种干细胞来源红系细胞的形态,运用流式细胞术和实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)从整体上分析不同来源红系细胞膜蛋白的表达模式的异同,通过免疫荧光染色对两种来源红系细胞的胞内蛋白和跨膜蛋白即带3蛋白(Band3)进行检测,辅助判断红系细胞的成熟度。结果:1、hESCs/mAGM-S3共培养阶段可产生大量“鹅卵石”样的造血干/祖细胞,以及较高比例的GPA阳性的细胞。将上述细胞和hCB-MNCs-CD34+细胞分别进行半固体培养,均可产生BFU-E,Mix及其他髓系集落。2、hESCs/mAGM-S3共培养第12天的GPA+细胞还处于原始红细胞阶段;而通过后期的集落培养产生的BFU-E是一个以中、晚幼红细胞为主的异质性细胞群,这与hCB-MNCs-CD34+细胞诱导产生的BFU-E相似。3、相较于对照组(hCB-MNCs-CD34+细胞来源),hESCs/mAGM-S3共培养阶段的红系细胞还很幼稚,表型分子的表达还处于幼稚阶段,也几乎不表达相关基因,但通过后期集落培养,膜蛋白基因的表达在不断增强。需注意的是,CD49d和CD29表达情况的降低趋势并不如对照组明显。4、hESCs来源的Mix集落红系细胞膜蛋白基因表达整体低于相同细胞来源BFU-E集落。5、hESCs诱导而来的BFU-E细胞无论是基因水平还是蛋白水平都表达较高比例的Band3。结论:1、hESCs与mAGM-S3基质细胞共培养可产生大量造血干/祖细胞,具有成体造血的特性。2、hESCs/mAGM-S3共培养阶段红系细胞的表型分子发育处于幼稚阶段,也几乎不表达膜蛋白相关基因,但通过后期集落培养,其膜蛋白发育不断成熟,表明随着红系细胞发育成熟,膜蛋白的表达也随之变化,并且接近成体来源模式。3、hESCs诱导而来的红系细胞的膜蛋白具有成体来源特性,表达较高比例的β-globin和Band3,将两者结合一起可评价hESCs来源红系细胞的成熟度。4、hPSCs来源红系细胞的膜蛋白的表达模式总体而言接近成体来源,但也具有一定的差异,可辅助监测本实验体系红系的发育进程。