研究背景与目的大肠癌是全球常见的消化道恶性肿瘤，严重危害人类健康。转移是大肠癌的重要生物学行为，也是肿瘤患者死亡的主要原因之一。因此，确定肿瘤的转移潜能及其相关因素对判断预后、指导治疗、提高生活质量具有十分重要的意义。肿瘤转移过程涉及一系列复杂的分子事件，是多步骤、多因素、多基因共同参与的复杂病理过程，包括转移相关基因的突变、激活，肿瘤细胞的黏附、迁移、增殖，细胞外基质降解，组织免疫性及肿瘤血管形成等变化，并通过细胞基因表达调控机制调节肿瘤转移的发生和发展，最终由功能性蛋白质表达来完成肿瘤转移的全过程。传统意义上，基因组学的研究多数是针对单个或几个致病基因和蛋白质进行分析，而蛋白质组学是研究细胞内全部蛋白质的组成和动态变化的一门新兴学科。在疾病的每个病理阶段，蛋白质的组成、表达水平、修饰、细胞内定位以及功能等都是高度动态的，这些变化可能引起细胞功能发生改变。分析和鉴定全部蛋白质功能及变化即是蛋白质组学的目标。有效的蛋白质组学技术能从整体水平上高效、高通量、实时地对肿瘤细胞蛋白质组进行动态分析。蛋白质组学的核心技术是双向凝胶电泳(2-DE)和质谱(MS)，前者是分离复杂组分蛋白质的最常用方法，后者是鉴定感兴趣蛋白质点的有效工具。大量研究显示，2-DE联合MS是分离和鉴定肿瘤差异表达蛋白质最常用的方法。目前，肿瘤蛋白质组学研究已广泛应用于肿瘤生物学标记物的筛选和鉴定、肿瘤分类、治疗及肿瘤发生机制等方面。国内外学者通过2-DE-MS，发现并初步鉴定出一些与肿瘤转移相关的蛋白质，为深入研究肿瘤转移蛋白质功能奠定了基础。为了筛选重要的大肠癌转移相关蛋白，为临床判断其生物学行为及预后提供较为可靠的指标，本课题利用2-DE联合基质辅助激光解析离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对一对人大肠癌不同转移潜能细胞株进行差异蛋白质组分析和鉴定。方法本研究采用一对国内外通用、来自同一亲本、遗传背景一致的人大肠癌高转移性细胞株SW620和低转移性细胞株SW480为实验对象。首先，利用2-DE技术分离比较SW620和SW480细胞株2-DE差异表达蛋白质图谱；通过Powerlook1100透射扫描仪获取2-DE凝胶银染图像，利用MelanieⅢ对图像进行背景消减、斑点检测、重复性及相关性比较等分析，选取二者差异表达的蛋白质点，作为最终质谱鉴定的对象。其次，利用MALDI-TOF-MS对两种细胞株的差异表达蛋白质点进行质谱分析，获得各蛋白质点的肽质量指纹谱(PMF)；通过Mascot和ProFound软件查询NCBInr数据库，筛选并初步鉴定出与大肠癌转移相关的蛋白质。而后，把SW480细胞株筛选出的特异表达蛋白质钙依赖磷脂结合蛋白Ⅰ(AnnexinⅠ)作为靶蛋白，利用细胞免疫组化和Western免疫印迹验证AnnexinⅠ蛋白在两种细胞株的表达情况。最后，利用核酸原位杂交和免疫组化方法，分别从mRNA和蛋白水平上检测AnnexinⅠ在大肠正常黏膜、大肠癌及淋巴结转移癌中的表达情况，阐述该基因和蛋白与大肠癌浸润转移的相关性，并探讨其临床意义。结果1．SW620和SW480细胞株2-DE差异表达蛋白质图谱的结果分析MelanieⅢ软件分析3次相同条件下SW620和SW480细胞株2-DE图谱，结果显示重复性、匹配性较好。SW620检测到(1316±62)个蛋白质点，平均匹配率82％：SW480检测到(1332±74)个蛋白质点，平均匹配率80％。蛋白质点pI和Mr分布广泛，以pI4～7、Mr 20～70kDa范围内分布最多。两种细胞株蛋白质点散点图分析结果显示相关系数为0.891，说明二者可比性较强。两种细胞株差异表达蛋白质点有25个，其中11个(SW480.1～SW480.11)仅在SW480中表达，14个(SW620-1～SW620-14)仅在SW620中表达。2．25个差异蛋白质点的MALDI-TOF-MS分析及数据库鉴定25个差异蛋白质点进行胰酶胶内酶解及MALDI-TOF-MS分析，共获得23张PMF。分别通过Mascot和ProFound软件搜索NCBInr数据库，数据库查询结果：高度匹配已知蛋白质3个，分别是PGAMl、Galectin-1和AnnexinⅠ，初步匹配已知蛋白质或片段14个，未查到匹配已知蛋白质或片段6个。其中高转移性细胞株SW620中人硫氧还蛋白和泛素偶联酶特异性表达，可能对大肠癌转移起促进作用。低转移性细胞株SW480中AnnexinⅠ、Galectin-1、钙调蛋白、主要组织相容性复合体Ⅱ类抗原、超氧化物歧化酶、Rab相关GTP结合蛋白和cofilin特异性表达，可能对大肠癌转移起抑制作用。在这些差异表达的蛋白质中，部分蛋白质与基因转录、细胞周期、信号转导、细胞凋亡等有关，可能参与大肠癌的分化、增殖、侵袭、黏附和转移等多种生物学行为。提示大肠癌转移过程的发生是多种蛋白质功能共同作用的结果，它们通过相应的机制分别或相互协调共同促进或抑制大肠癌的转移。3．免疫组化及Western免疫印迹验证AnnexinⅠ蛋白在SW620和SW480细胞株中的表达AnnexinⅠ在SW480中呈弥漫强阳性表达，而在SW620中呈局灶阳性表达。Western免疫印迹结果显示SW480中AnnexinⅠ的表达强度明显强于SW620。4．免疫组化检测AnnexinⅠ蛋白在正常大肠黏膜、大肠癌及淋巴结转移癌中的表达及临床意义在蛋白水平，AnnexinⅠ在正常组不表达，而在大肠癌无转移组和转移组中表达上调，三组表达差异具有显著性(H=19.801，P=0.000)。表达与大肠癌淋巴结转移呈正相关性(Z=-2.554，P=0.011)，但表达与大肠癌不同组织学类型(H=0.678，P=0.839)和不同病理分级(H=0.470，P=0.747)均无相关性。大肠癌转移组中原发癌和淋巴结转移癌表达差异无显著性(Z=-0.737，P=0.461)。5．核酸原位杂交检测AnnexinⅠmRNA在正常大肠黏膜、大肠癌及淋巴结转移癌中的表达及临床意义在mRNA水平，AnnexinⅠ在正常组全部表达，而在大肠癌无转移组和转移组中表达下调，三组表达差异具有显著性(H=23.714，P=0.000)。表达与大肠癌不同病理分级相关(H=5.813，P=0.034)，但表达与大肠癌不同组织学类型(H=4.916，P=0.128)及有无淋巴结转移(Z=-0.908，P=0.364)均无相关性。大肠癌转移组中原发癌和淋巴结转移癌表达差异无显著性(Z=-0.825，P=0.409)。结论1．蛋白质组学技术是快速、有效筛选大肠癌转移相关蛋白的理想方法。本课题应用2-DE技术，获得了分辨率高、重复性好的人大肠癌不同转移潜能细胞株SW620和SW480蛋白质表达图谱。2．人大肠癌不同转移潜能细胞株SW620和SW480具有明显的差异表达蛋白质图谱，共分离鉴定出9种可能与大肠癌转移相关的蛋白质。其中，高转移性细胞株SW620中人硫氧还蛋白和泛素偶联酶特异性表达，可能对大肠癌转移起促进作用。低转移性细胞株SW480中AnnexinⅠ、Galectin-1、钙调蛋白、主要组织相容性复合体Ⅱ类抗原、超氧化物歧化酶、Rab相关GTP结合蛋白和cofilin特异性表达，可能对大肠癌转移起抑制作用。提示大肠癌转移过程的发生是多种蛋白质功能共同作用的结果，它们通过相应的机制分别或相互协调共同促进或抑制大肠癌的转移。3．细胞免疫组化和Western免疫印迹证实低转移性细胞株SW480 AnnexinⅠ蛋白表达强于高转移性细胞株SW620。4．AnnexinⅠ蛋白表达与大肠癌发生发展和转移密切相关，与不同组织学类型和肿瘤分化程度无关。AnnexinⅠ蛋白可作为反映大肠癌生物学行为和判断预后的重要指征，并为大肠癌特异性基因治疗提供有价值的理论依据。5．AnnexinⅠmRNA表达与大肠癌发生及肿瘤分化程度密切相关，但与大肠癌有无淋巴结转移和不同组织学类型无关。