肌腱病(tendinopathy)是骨科学、运动医学和职业病医学的常见病之一。统计表明，每年至少有3000万的肌腱病病例。大量研究表明：过度牵伸载荷导致肌腱的微损伤及不成熟的修复是其发生的直接原因，但确切的发病机制尚不清楚。临床上对肌腱病的治疗主要包括物理治疗、修复与重建。修复手术包括：局部病灶清除等；重建手术主要针对肌腱病修复失败；目前重建手段有：自体肌腱移植、同种异体肌腱移植，组织工程肌腱移植等。面临的共同问题是：缺乏具有强烈修复能力的细胞、缺乏促进肌腱修复的微环境。近年来，随着细胞治疗及干细胞治疗研究的发展，人们开始使用细胞疗法和干细胞疗法来促进肌腱的恢复。常用的细胞包括成纤维细胞、胚胎干细胞(ESCs)、骨髓间充质干细胞(BMSCs)、脂肪干细胞(ADSCs)等等。2007年，Bi et al.发现肌腱里含有新的类型细胞—肌腱干/祖细胞(Tendon stem/progenitor cells, TSCs)。是肌腱细胞的前体细胞，这些细胞具有干细胞的普遍特征；TSCs在生理状态下可分化、增殖成肌腱细胞；TSCs在病理状态下可分化为成骨、成脂、成软骨细胞及成肌腱细胞；TSCs对肌腱损伤修复及保持肌腱微环境起着关键性的作用；TSCs的发现势必为运用干细胞治疗的方法治疗肌腱病提供可能。肌腱是连接肌肉和骨骼的纤维结缔组织，经常要承受很强的机械压力，从而传递肌肉产生的张力维持关节的活动和稳定。在受力的过程中，肌腱会改变新陈代谢，并适时改变其结构及力学特性。因此，深入理解新分离的TSCs对机械压力的响应，将对我们了解肌腱在受力环境下生理学的变化非常必要。富血小板血浆(platelet-richplasma, PRP)含有大量的生长因子，如PDGF、EGF、TGF-β1、IGF等，这些因子对肌腱的修复及保持肌腱微环境具有很大的促进作用。有文献报道，PRP的激活态(PRCR)能促进TSCs的增殖及胶原蛋白的产量。在体内，PRCR促进了肌腱细胞的增殖及I型、III型胶原蛋白的表达，而这些是肌腱的主要组成部分[8]。然而，TSCs在受力过后，PRCR对TSCs分化的作用并未见报道。本研究将详细研究PRP对受力后的TSCs的影响，以进一步确定PRP对肌腱修复的作用及其机制。目的：1、通过分离、鉴定大鼠肌腱干细胞(TSCs)，发现其具有干细胞的普遍特性，包括克隆、增殖、多向分化潜能；2、明确机械牵拉对TSCs增殖及分化的影响；3、探查富血小板血浆对TSCs增殖及分化的影响；4、分析富血小板血浆复合TSCs对肌腱急性损伤的作用；5、通过富血小板血浆复合TSCs为肌腱病修复提供新的手段。方法：1.大鼠肌腱干细胞的分离、培养及鉴定：8周龄SD大鼠取后肢的跟腱，分离、培养具有多向分化潜能的肌腱干细胞。研究其克隆形成能力及不同代数的形态学变化。采用流式细胞术测定干细胞表面抗原标志，利用免疫荧光检测肌腱相关蛋白及软骨相关蛋白的表达，并研究其向成骨、成脂及成软骨细胞方向分化的能力。2.机械载荷对TSCs增殖及分化的影响：我们首先研制出一套TSCs循环牵伸载荷系统，建立体外肌腱干细胞过度牵拉模型并予以测试。使用这套体外装置，我们系统的研究了不同强度的机械牵拉对TSCs形态学、增殖、周期及凋亡的影响，并通过检测成骨、成脂、成软骨标志基因的表达来分析TSCs分化的改变。3.富血小板血浆对TSCs增殖及分化的影响：研究TSCs在受力过后，PRP对TSCs增殖、分化及相关基因表达的影响。应用Western blot检测肌腱细胞、脂肪细胞及成骨细胞标志蛋白的表达，并通过流式细胞术确定各组阳性细胞所占的比例。应用ELISA检测TGF-β1与VEGF的表达。4.富血小板血浆复合肌腱干细胞治疗急性肌腱损伤：48只经肉毒杆菌毒素处理的大鼠作为unloaded组，另外48只作为loaded组。随机将大鼠分为4组：A组—PBS处理，B组—PRP处理，C组—TSCs处理，D组—PRP+TSCs处理。移植后3天及14天，取跟腱组织进行组织学、免疫组化及基因表达检测。5.富血小板血浆复合肌腱干细胞治疗慢性肌腱损伤：26只大鼠通过度运动建立慢性肌腱病模型。其中24只大鼠被随机分为4组，并做相应的注射处理：对照、PRP、TSCs、PRP+TSCs。剩下的两只通过注射绿色荧光蛋白标记的TSCs做体内细胞示踪实验。4周及8周后，取材并分析肌腱组织的病理组织学及基因表达情况，以评价肌腱组织的修复情况。结果：1.成功的分离出大鼠肌腱干细胞TSCs。TSCs具有克隆形成能力及很高的增殖能力。经流式细胞术分析，TSCs表达干细胞标志CD44及CD90，CD34及CD31表达均为阴性。免疫荧光结果表明，P3代TSCs表达α-SMA、tenascin C、aggrecan及Col I呈阳性，而Col II表达阴性。TSCs具有向成骨、成脂、成软骨细胞分化的能力。2. TSCs在受力条件下，细胞沿微槽贴壁生长良好，细胞明显拉长；细胞增殖能力增加，并随着受力强度的增加而大幅增加；4%机械拉伸有利于TSCs向肌腱细胞方向分化。而加载8%机械拉伸后对TSCs向多个方向的分化均有利。3.富血小板血浆明显促进了TSCs增殖，并促进I、III型胶原、TGF-β1的表达。同时，成骨及成脂标志基因明显降低，表明TSCs受力过后，PRP促进了其向肌腱细胞方向分化，并抑制向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞分化，从而降低了脂肪小滴累积、粘液性的变性及组织的钙化。4.在受力条件下，TSCs复合PRP处理对急性肌腱损伤愈合具有协同促进作用。受力促进了TSCs的增殖及分化成肌腱细胞，改善了肌腱的修复效果，I、III型胶原及Smad8的表达量增加。5. TSCs复合PRP改善了慢性肌腱损伤肌腱的结构，胶原含量增加。8周后注射的TSCs仍然存活，并可实现追踪。免疫组化结果显示，PRP复合TSCs移植增加了损伤肌腱处I、III型胶原的表达，而Rundx2、PPARγ、SOX9的表达受到抑制。结论：1. TSCs的成功分离和鉴定有助于我们更清晰的了解其在肌腱生理、康复及发病过程中的作用，从而为运用干细胞治疗的方法治疗肌腱病提供可能。2.适度的压力可能会促进TSCs自我更新或向肌腱细胞分化，而高强度的压力是有害的，因为它诱导TSCs向非肌腱细胞分化，如脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞，或三者的混合体，在体内表现为脂肪积累、类粘蛋白形成或组织钙化等肌腱病症状。3.富血小板血浆通过诱导TSCs向肌腱细胞分化，从而抑制形成脂肪细胞、软骨细胞及成骨细胞，进而促进肌腱功能的康复4. TSCs+PRP是一种非常有希望的治疗肌腱病的方法。